|
REVISTA DE REUMATOLOGÍA
Terapia Génica y Autoinmunidad
Dra. Luz Marina Restrepo, Ph D
Profesora Universidad de Antioquia - CIM
Generalidades
La terapia génica representa una estrategia terapéutica que utiliza la información genética como agente farmacológico. Originalmente concebida para tratar enfermedades hereditarias, en la actualidad representa una forma importante de liberar proteínas terapéuticas en una forma local o sistémica; sus aplicaciones se extienden a enfermedades tales como el cáncer, infecciones adquiridas, enfermedades neurodegenerativas, enfermedades autoinmunes, corrección de defectos metabólicos etc; igualmente la transferencia de genes constituye una estrategia tecnológica importante que permite la disección y esclarecimiento de un sinnúmero de fenómenos biológicos básicos. Existen dos tipos de aproximación: ex vivo e in vivo. En la primera, las células son removidas del receptor potencial, se modifican genéticamente en el laboratorio y luego se retornan al receptor. Ejemplos de esta estrategia están representados en la modificación de linfocitos T para el tratamiento en la deficiencia en adenosina deaminasa, (ADA)(1,2), de hepatocitos para la hipercolesterolemia familiar(3),y linfocitos infiltradores de tumores (TIL) para enfermedades neoplásicas(4).
El método in vivo implica la transducción directa del gen, bien sea terapéutico o marcador en las células del receptor y ha sido utilizada tanto en modelos animales como en humanos para el tratamiento de enfermedades como la fibrosis quística y algunas neoplasias.
La terapia génica somática consiste en la introducción de las modificaciones genéticas que se espera sean curativas, en las células somáticas de un organismo, sin modificar las células germinales. Tres componentes indisociables son necesarios: un gen de interés, del cual se espera que la expresión en una célula normal se acompañe de un efecto terapéutico, la célula blanco de la modificación y finalmente un vehículo del material genético o vector que permite introducir el gen de interés en la célula blanco(5). Los avances en medicina molecular han generado un entusiasmo considerable por la terapia génica; esta forma de tratamiento está siendo aplicada en más de 150 protocolos que implican más de 1000 pacientes(6). Los protocolos clínicos incluyen tanto protocolos de marcación, como protocolos terapéuticos y su aplicación tiene una regulación especial en cada país. En EE UU el país con mayor número de protocolos clínicos aprobados, el organismo que regula la aplicación de los mismos, es el RAC (Recombinant Advisory Committee).
Paralelamente a los aspectos científicos, la terapia génica genera problemas de orden ético y social, tanto para el paciente como para el personal hospitalario y para el medio ambiente. Los beneficios esperados deben ser cuidadosamente evaluados en función de los riesgos posibles y de la pertinencia de las aproximaciones terapéuticas alternativas disponibles.
Métodos de transferencia génica
El éxito de una transferencia depende de la disponibilidad de un sistema apropiado y debe asegurar:
1) Una transferencia eficaz en una mayoría de células blanco.
2) La estabilidad de los genes introducidos, los cuales deben preferiblemente integrarse en el genoma de la célula blanco, de ser posible, en un sitio específico.
3) La expresión estable y apropiada de la información genética introducida. Entre los factores que limitan la expresión del gen tenemos: la reconversión de la población celular transducida, las reacciones inmunes contra los productos del transgen o de los genes virales y finalmente la pérdida del promotor.
4) Condiciones de seguridad que respondan a las normas existentes tanto para el paciente como para el medio ambiente.
Varios métodos han sido desarrollados para liberar y expresar genes exógenos in vitro e in vivo(5), estos incluyen:
1). Los sistemas químicos (precipitación con fosfato de calcio, DEAE-dextran, polybreno, liposomas neutros, aniónicos, catiónicos y conjugados de polilisina).
2). Los sistemas físicos (microinyección, electroporación, biobalística).
3). Los sistemas biológicos (vectores virales). Entre estos se encuentran los vectores los retrovirus etc.derivados del herpes virus (HSV), los adenovirus, los virus asociados a los adenovirus (AAV),
A pesar de los avances obtenidos en el diseño de los diferentes tipos de vectores, hasta el momento ningún sistema vectorial cumple con todas las condiciones para convertirlo en el sistema ideal; sin embargo, los vectores virales son todavía los más eficaces y entre ellos los vectores retrovirales son los más utilizados. Los primeros ensayos clínicos se realizaron con este tipo de vectores y en la actualidad la mayoría de los mismos implica la utilización de estos vectores, pues han demostrado buena eficiencia y seguridad.
Los vectores retrovirales no pueden replicarse, pero tienen la capacidad de infectar; en un ciclo abortivo la célula blanco; las partículas virales defectivas son producidas por líneas celulares de empaquetamiento, especialmente diseñadas para producirlas. En estos vectores la mayor parte de las regiones codificadoras para las proteínas estructurales gag, pol y env son reemplazadas por el gen o genes de interés. La cantidad de DNA que puede ser insertado en un vector de este tipo varía, pero generalmente hasta 8 kb puede vectorizarse por este sistema(7). Hasta el momento no se han reportado efectos secundarios debidos a la utlilización de los mismos, a pesar de que su integración es al azar y de que podrían representar un riesgo si ocurriera inactivación de un gen supresor de tumores o bien activación de un oncogen. De otro lado el hecho de que se integren, permite una expresión a más largo plazo del gen insertado.
Los vectores adenovirales también han sido ampliamente utilizados, requieren igualmente un sistema de complementación tal como la línea celular 293 modificada para que produzca constitutivamente los elementos E1, que son suprimidos en el vector adenoviral. Estos vectores tienen ventajas desde el punto de vista del tamaño del gen que pueden insertar (hasta 20 kb), pero tienen limitaciones desde el punto de vista inmunológico, puesto que es necesario hacer aplicaciones repetidas de los mismos lo cual ha generado respuestas inmunes e inactivacion del vector(8).
En cuanto a los vectores derivados de virus asociados a los adenovirus, aunque inicialmente despertaron un gran interés debido a que la integración del virus salvaje es específica en el cromosoma 19 en el humano, rápidamente se vió que esto no ocurría con los vectores derivados de estos virus. Por otra parte, el tamaño del gen que pueden vehicular es bastante limitado (menos de 4 kb).
Los vectores derivados del Herpes virus son interesantes debido a su tropismo específico por el sistema nervioso central, por el tamaño del gen que pueden vectorizar y por su título alto. Sin embargo, es un sistema que apenas está en desarrollo; los producidos hasta el momento sólo permiten expresión transitoria del gen de interés y su eficiencia de transducción es baja.
En términos generales, los sistemas virales son mas eficientes que los no virales y resultan en niveles de expresión más altos y por períodos de tiempo más prolongados. Los sistemas no virales sin embargo son más económicos y más fáciles de producir; además, como los vehículos no virales no son antigénicos es posible administrarlos repetidamente y presentan menos riesgos patológicos(8).
Aunque inicialmente el desarrollo de esta nueva tecnología estuvo en manos de los centros académicos, en la actualidad muchas firmas biotecnológicas se interesan en la terapia génica y la tendencia actual es lograr acuerdos con los centros académicos, para desarrollar productos farmacéuticos para terapia génica aplicada al humano.
Enfermedades autoinmunes:
Recientemente estrategias derivadas de la terapia génica han sido utilizadas para el tratamiento de enfermedades autoinmunes. Células blanco de ataques autoinmunes pueden modificarse genéticamente para expresar citoquinas inmunoreguladoras que las protegen de la autodestrucción inmune. Tales células incluyen por ejemplo, las células beta pancreáticas en la diabetes mellitus tipo I insulino-dependiente, los oligodendrocitos productores de mielina en la esclerosis múltiple y los sinoviocitos en la artritis reumatoidea. Igualmente, la modificación genética de células de memoria T autorreactivas y de las células blanco autoinmunes para que produzcan citoquinas inmunorreguladoras y factores de crecimiento regenerativos ofrecen una nueva promesa para el tratamiento de las enfermedades autoinmunes(9).
Es crucial que los factores inmunorreguladores apropiados sean bien seleccionados y que su expresión esté confinada al tejido blanco autoinmune; un diseño que implique la expresión inducible del transgen (expresión solamente cuando sea necesario durante el ataque autoinmune) sería lo ideal. Los factores terapéuticos se producirían de una manera no constitutiva y antígeno inducida; esto confinaría la producción del factor terapéutico al medio autoinmune; además es también importante que el factor transgénico sea tejido específico, lo cual puede lograrse mediante el uso de promotores tejido específicos en el diseño de los plásmidos y vectores. En este sentido los ejemplos más notables incluyen los dirigidos a la expresión en oligodendrocitos y el promotor de la insulina cuya expresión está dirigida a las células beta pancreáticas.
En enfermedades que afectan sitios anatómicos discretos localizados, tales como la tiroiditis o la osteoartritis, es factible pensar en la aplicación terapéutica de los genes directamente en el sitio de la patología. Bajo estas condiciones, las concentraciones más altas de los productos génicos se acumularían dentro del órgano afectado, con exposición reducida en órganos que no son blanco de la enfermedad. Esto maximiza el beneficio terapéutico y minimiza los efectos adversos colaterales. Para enfermedades más diseminadas como el lupus eritematoso puede ser más ventajoso introducir genes inmunorreguladores a los sitios de presentación antigénica tales como los nódulos linfoides o a células inmunocompetentes como los linfocitos para que su producto pueda circular sistémicamente(10).
Artritis reumatoidea
La Artritis Reumatoidea (AR) es una enfermedad autoinmune caracterizada por inflamación crónica de las articulaciones como resultado de la infiltración de monocitos y la progresiva destrucción del cartílago y del hueso. Su patofisiología está principalmente controlada por citoquinas proinflamatorias tales como la interleuquina 1 (IL-1), producida por macrófagos, fibroblastos y células endoteliales del sinovio reumático. El mayor impacto de la IL-1 en la patofisiología de la AR es la estimulación de los sinoviocitos para producir enzimas degradantes de cartílago como colagenasa y estromelisina; igualmente, citoquinas quimiotácticas como la IL-8 y otros mediadores inflamatorios como el óxido nítrico. La IL-1 también provoca la liberación de enzimas degradantes de cartílago por los condrocitos. Por lo tanto, su bloqueo puede reducir tanto la degradación del cartílago como la inflamación. Otro factor proinflamatorio importante es el factor de necrosis tumoral alfa (TNF alfa)(11).
Se ha demostrado también que durante la enfermedad, se produce un incremento en la expresión endógena de IL-10 por las clonas de células T en el sinovio. La IL-10 es una citoquina producida por células del tipo Th2 que actúan predominantemente con efecto inmunosupresor a través de la retroregulación de las funciones de los macrófagos y de las citoquinas proinflamatorias producidas por las células Th1 como IL-1 beta, IL-6, IL-8, TNF-alfa, IFN-gama y factor estimulador de colonias de granulocitos-macrófagos GM-CSF(9-11). Se ha sugerido que esta citoquina puede ser el mayor mediador endógeno de inmunosupresión que previene la expresión y el desarrollo de la enfermedad(11).
Aproximaciones terapéuticas con terapia génica en la artritis reumatoidea:
Se ha demostrado experimentalmente que los genes pueden ser utilizados como agentes terapéuticos en enfermedades inflamatorias. Algunos ejemplos están representados en modelos experimentales del lupus, la esclerosis múltiple, la osteoartritis. Sin embargo, los progresos más importantes se han obtenido en el marco de la artritis reumatoidea. Las aplicaciones de la terapia génica para el tratamiento de esta y otras enfemedades articulares está siendo explorada para salvar las barreras y limitaciones que presenta la liberación de drogas en el tejido articular. Las investigaciones están orientadas en dos áreas principales:
1. La evaluación de aproximaciones con liberación de genes
2. La identificación de productos génicos terapéuticos.
Con respecto a esta patología todavía no es claro cual estrategia (liberación local o liberación sistémica) sea la más conveniente. Se ha obtenido un progreso considerable con la liberación local de genes en las células sinoviales tanto in vivo como ex vivo e igualmente por administración sistémica de vectores liberadores de productos génicos via circulación. En la artritis reumatoidea las aplicaciones ex vivo, permiten por ejemplo el uso de vectores retrovirales los cuales transducen células que se dividen poco in vivo pero que lo hacen rápidamente in vitro tales como los fibroblastos sinoviales y los condrocitos. Las estrategias ex vivo permiten igualmente la selección, monitoreo y evaluación desde el punto de vista de eficiencia y seguridad de las células genéticamente modificadas antes de la reimplantación en el individuo. Una estrategia interesante en el tratamiento con genes de la artritis reumatoidea es transferir genes anti-artríticos en el espacio sinovial de las articulaciones del individuo afectado, o en lugares extra-articulares en donde los productos del gen son accesibles sistémicamente(11). Posibles blancos de la última aproximación incluyen los linfocitos, células de médula ósea, hígado, piel y músculo. Para la introducción del gen a nivel local, el sinovio es un blanco atractivo. Se ha demostrado que el sinovio en la AR no sólo invade profundamente el cartílago, sino que además produce enzimas degradadoras de la matriz en el sitio de destrucción. Estas células son interesantes como blanco de modificación debido a su gran área superficial, su facilidad de acceso y su contacto directo con el espacio articular(11). En el procedimiento el sinovio es recuperado quirúrgicamente desde las articulaciones, las células sinoviales se cultivan in vitro, se modifican con un vector que porta los genes de interés y luego se regresan a la articulación por inyección intra articular. Los sinoviocitos autotransplantados transducidos son capturados por el sinovio en donde continúan expresando los transgenes.
La transducción de genes in vivo al espacio sinovial de las articulaciones puede ser obtenida mediante adenovirus, HSV, AAV, liposomas, DNA desnudo.
Además de la liberación de genes de citoquinas inmunorreguladoras o anti-inflamatorias al sinovium, es posible liberar genes suicidas tal como el gen de la timidina kinasa del herpes virus, el cual cuando es administrado con ganciclovir dentro y alrededor del sinovium destruye selectivamente las células que lo poseen.
Entre los genes más estudiados y promisorios desde el punto de vista de tratamiento por terapia génica de la AR tenemos el receptor antagonista de la IL-1 (IL-1Ra o IRAP), que inhibe competitivamente las actividades biológicas de la IL-1( 12, 13) al ocupar el receptor tipo I de la misma. Se ha demostrado que la liberación del gen del IL-Ra confiere protección contra la artritis antígeno inducida del conejo, la artritis inducida por la pared del estreptoco en la rata, la artritis inducida por colágeno y zimosan en el ratón. Su sobreexpresión puede reducir considerablemente la destrucción pericelular del cartílago mediada por condrocitos(14).
Otro gen que ha sido ampliamente utilizado es el que codifica para la IL-10; la tranferencia de genes de la IL-10 viral (vIL-10) con un vector retroviral, prolonga significativamente la supervivencia de un alotransplante cardíaco murino, induciendo inmunosupresión local. Estudios más recientes(15) para determinar la eficiencia de la transferencia del gen para la vIL-10 mediada por adenovirus(AdvIL-10) en la incidencia y severidad de la AIC (artritis inducida por colágeno) murina mostraron que la administración sistémica de adenovirus portadores del gen para la vIL-10, pero no los controles con otros adenovirus recombinantes, puede inhibir el inicio de AIC y reducir los síntomas clínicos e histopatológicos del modelo autoinmune animal. Este efecto es dependiente de la dosis y es inhibido específicamente por anticuerpos anti-vIL-10. Estos datos sugieren que la transferencia génica de vIL-10 mediada por adenovirus puede ser una alternativa válida de terapia para la artritis por su acción combinada anti-inflamatoria y condroprotectora. En este mismo modelo se estudió la relación entre la IL-12 y la actvidad de la enfermedad mediante la introducción sistémica intraperitoneal de un adenovirus recombinante para este gen, demostrando que la IL-12 es un importante inmunomodulador en la artritis murina que puede regular la expresión de ciertas quemoquinas proinflamatorias(16). De otro lado, Xing et al., detectaron producción de IL-10 murina (mIL 10) en el suero de ratones, luego de la inyección intramuscular de mIL-10 vehiculada en un vector adenoviral recombinante.
En intentos para hacer transposicion al humano se han realizado estudios utilizando como modelo la transferencia de tejidos humanos en ratones SCID. Fibroblastos sinoviales reumatoideos humanos han sido implantados con cartílago humano normal en estos ratones. Los estudios preclínicos han demostrado tanto la eficiencia como la seguridad de los protocolos y llevaron al primer ensayo clínico en el marco de tratamiento de la AR en 1996 en EEUU(17). Se utilizaron vectores retrovirales para transferir el cDNA del IL-1Ra ex vivo en 9 pacientes con AR. El propósito era establecer la seguridad y posibilidades y confirmar si era factible transferir genes potencialmente anti-artríticos a las articulaciones de los pacientes con AR y expresarlos intra-articularmente. Los resultados iniciales han generado un gran entusiamo.
Ejemplos representativos de genes y medios de liberación utilizados como modelo para el estudio y tratamiento de la AR.
Producto génico Vector Ex vivo (E) Local (L) Célula transducida
In vivo (I) Sistémica (S)
IL-Ra Retrovirus E L Fibroblasto Sinovial
IL-Ra Retrovirus E L Fibroblasto Sinovial
IL-Ra Retrovirus E L 3T3
sTNF-R, TGF-b Retrovirus E S Esplenocitos
vIL-10, sIL-1R,
sTNFR Adenovirus I L Intra Articular.
vIL-10 Adenovirus I L Intra Articular
FasL Adenovirus I L Intra Articular
Ninguno Liposoma I L Intra Articular
vIL-10 Adenovirus I S Intra Venoso
TGF-beta Plásmido I S Intra Muscular
IL-10 Plásmido I L Intra Articular
IL-13, IL-4 Plásmido E S Células CHO
Tomado con modificaciones de Evans et al (11).
A medida que los mecanismos moleculares y los mediadores que regulan la patología en la AR lleguen a ser dilucidados más precisamente, el potencial de una terapia génica que pueda alterar específicamente estas vías esenciales en las primeras etapas de la enfermedad conllevará posiblemente a un mejor tratamiento de los pacientes.
Referencias
1. Blease M, Culver K, Anderson WF et al. T Lymphocyte-Directed Gene therapy for ADA- SCID. Initial trial results after 4 years. Science 1995; 270: 475-480.
2. Bordignon C, Notarangelo LD, Nobali N et al. Gene therapy in peripheral blood lymphocytes and bone marrow for ADA Immunodeficient patients. Science. 1995; 270.
3. Grossman M, Raper S; Kozarsky K et al. Successful ex vivo gene therapy directed to liver in a patient with familial hypercholesterolaemia. Nat Genet. 1994; 6: 335-341.
4. Rosenberg, SA. TNF/TIL human gene therapy protocol. Hum Gene Ther 1990; 1: 443-62.
5. Garry, PN and Allan R S. Expression vectors and delivery systems. Current Opinion in Biotechnology, 1998; 447-450.
6. Valère, T. Thérapie génique: le point sur les essais cliniques. Médecine/Sciences 1996; 12: 73-83.
7. Mulligan, RC. The basic science of gene therapy. Science 1993; 260: 926-32.
8. Wolff, JA an Lederberg J. A history of gene transfer and therapy. Chapter 1 in Wolff JA, editor, Gene therapeutics : Methods and applications of direct gene transfer. 1994; 3-25.
9. Mathisen PM and Vincent K Tuohy. Gene therapy in the treatment of autoimmune disease. Immunol Today. 1998; 19: 103-105.
10. Christian Jorgensen and Steffen Gay. Gene therapy in osteoarticular diseases: where are we?. Immunol Today. 1998. Sep.
11. Evans CH, Ghivizzani SC, Robbins PD, Blocking cytokines with genes. J Leukocyte Biol. 1998; 64: 55-61.
12. Makarov SS, Olsen JC, Johnston WN et al. Suppression of experimental arthritis by gene transfer of interleukin 1 receptor antagonist cDNA. Proc Natl Acad Sci. USA. 1996; 93: 402-406.
13. Otani K, Nita I, Macaulay W et al. Suppression of antigen-induced arthritis in rabbits by ex vivo gene therapy. Journal of Immunol. 1996; 156: 3558-62.
14. Ladner UM, Roberts CR, Franklin BN et al. Human IL-1Ra gene transfer into human synovial fibroblasts is chondroprotective. Journal of Immunol. 1997; 158: 3492-3498.
15. Apparailly F, Verwaerde C, Jacquet C et al. Adenovirus Mediated transfer of viral IL-10 gene inhibits murine collagen-induced arthritis. Journal of Immunol. 1998; 160: 5213-5220.
16. Parks E, Strieter RM, Lukacs NW et al. Transient gene transfer of IL-12 regulates chemokine expression and disease severity in experimental arthritis. Journal of Immunol. 1998; 160: 4615-19.
|
