CARCINOMA ORAL,OBJETIVOS DE ESUDIO

CARACTERIZACIÓN TOXICOLÓGICA DE UN MODELO DE
CARCINOMA ORAL TRANSPLANTABLE PARA BIOENSAYOS FARMACOLÓGICOS

Se seleccionaron los ratones IBF1, en quienes se logró la inducción de carcinomas epidermoides con la aplicación tópica del Condensado de Humo de cigarrillos, según metódica establecida (35). Ver ilustraciones que orientan de modo feaciente, las diferentes etapas morfológicas del proceso de carcinogénesis previos al ciclo de trasplantes "in vivo" (Figs. 1a,b,c,). Los tumores fueron resecados quirúrgicamente en condiciones estériles bajo flujo laminar previa asépsia y anestesia letal de los animales.

Figs. 1a; b; c:
Fotografías en las que se identifican las diferentes etapas evolutivas de los animales (Ratones IBF1) tratados con Condensado de Humo en el proceso de carcinogénesis. Obsérvese los cambios en el labio inferior desde el inicio (Fig 1a), hasta la aparición de neoplasias que infiltran estructuras anatómicas adyacentes. LLama la atención la aparición de tumores multifocales distantes a la lesión primaria (Fig. 1c).

Una vez tomadas las muestras para los estudios morfológicos, se realizó inoculación de fragmentos en solución salina a los primeros receptores a través de una aguja hipodérmica Nº 18. Los restantes pases seriados se efectuaron mediante una suspensión de células tumorales obtenida mediante un homogenizador de tejidos, ajustando la misma volumétricamente con solución salina fisiológica a una proporción 1:2. Ver en Fig.2 las características hísticas del mismo.

Fig.2:
Micrografía que evidencia carcinoma espinocelular bien diferenciado. Corte histológico correspondiente a pieza quirúrgica mostrada en Fig. 1c (H/E x 150).

En cada animal el trasplante se realizó depositando un inóculo subcutáneo de 0.2 ml de la suspensión tumoral descrita anteriormente en región axilar (ver Fig.4 donde se ilustra el prendimiento tumoral).

Fig.4:
Obsérvese un prendimiento positivo del tumor CETA trasplantado en un receptor IBF1.

Una vez esperado el tiempo de latencia tumoral, se procedió a la formación de los grupos experimentales para los diferentes estudios según la descripción de los métodos y procedimientos recomendados por la OMS para bioensayos de toxicidad (36).

Para evaluar el crecimiento de los tumores se determinó el volumen de los mismos. Para ello se midieron los dos diámetros principales y se sustituyeron en la siguiente fórmula(37):

Donde R₁ y R₂son los radios obtenidos a partir de las mediciones perpendiculares del tumor.

La inhibición del crecimiento tumoral (ICT) se calculó según la fórmula (37):

ICT = V tratado - V control....... x 100
----------------------------------
control

Donde V es el volumen promedio de los tumores en los grupos de animales tratados y controles.

MÉTODOS PARTICULARES EMPLEADOS EN LA
CARACTERIZACIÓN BIOLÓGICA DEL TUMOR
QUIMIOINDUCIDO (CETA)

Se seleccionaron 20 ratones machos IBF1 a quienes se les realizó trasplante de CETA según procedimiento explicado anteriormente. Las observaciones del prendimiento tumoral se realizaron a partir de las 24 horas de efectuado el mismo y volcadas en gráfico confeccionado al efecto. (Ver Figs. 3 y 4 en la que se identifica un convincente prendimiento tumoral).

Figs. 3a y b:
Necropsia efectuada a uno de los animales al final del primer ciclo de trasplante donde se aprecia tumoración implantada en región axilar (Fig. 3a). Pieza quirúrgica disecada (CETA- A851) para ser trasplantada a nuevos receptores (Fig. 3b).

Se seleccionaron 53 ratones machos IBF1 a quienes se les trasplantó el tumor CETA obtenido de los pases Nº 4, 15 y 27. Las defunsiones durante el período de duración de los experimentos fueron registrados en un libro de control, considerando como día 0 la fecha de implantación del tumor. Con el fallecimiento del último animal de cada estudio, se procedió al análisis de la sobrevida en los receptores de CETA en diferentes etapas del ciclo de trasplante seriado.

DISEÑO EXPERIMENTAL PARA EL ESTUDIO DE LA
RESPUESTA DE CETA A LA MONOQUIMIOTERAPIA

Se seleccionaron 52 ratones IBF1 hembras a las cuales se les trasplantó el tumor CETA en región axilar siguiendo metodología descrita.

En el presente estudio se emplearon 4 drogas antitumorales: la Ciclofosfamida (CFM) VEB Jenapharm, Alemania; Metrotexate (MTX) Medexport, Rusia; Bleomicin (BLEO) Nippon Kayaku Co., Ltd., Tokyo; Cisdiamino dicloro platino II (cis DDP), Empresa Laboratorios Farmacéuticos "Mario Muñoz", Habana, Cuba. Todas las sustancias fueron administradas por la vía intraperitoneal durante 5 días consecutivos una vez transcurridas 48 horas del trasplante.

CFM: .....25 mg/Kg (9 animales)

BLEO:.....2 mg/Kg (9 animales)

MTX: .....1 mg/Kg (9 animales)

DDP: .....1 mg/Kg (9 animales)

Nota: Fueron preparados dos grupos de 8 animales
cada uno como controles del experimento.

La evaluación de la actividad antineoplásica se realizó sobre la base de la supervivencia y por las medidas del volumen tumoral durante la evolución del experimento una vez concluídos los tratamientos antitumorales.

La disminución del volumen tumoral se calculó empleando fórmulas consignadas anteriormente.

DISEÑO EXPERIMENTAL PARA EVALUAR EL CARÁCTER
INMUNGÉNICO DE CETA Y SU CONDUCTA EN PARENTALES

Se seleccionaron 38 ratones machos IBF1 que fueron divididos en dos grupos de 21 y 17 animales a quienes se le inocularon diferentes concentraciones de CETA ajustados volumétricamente a 1:2 y 1:1 respectivamente. Cada animal recibió 0,05 ml de suspensión tumoral.

Este experimento tuvo una particularidad , se escogió como localización anatómica para la inoculación del tumor la región plantar (en pata derecha) siendo amputada la misma con margen de tejido sano a los 14 días de evolución (Figs.5a y b).

5 a

5 b

Figs. 5a; b;

Ilustración de metódica experimental para determinación del carácter inmunogénico.

(Fig. 5a) Prendimiento tumoral en pata derecha.
(Fig. 5b) Amputación a los catorce días.

Una vez terminada esta primera etapa se les reinoculó a los 14 días en pata izquierda una suspensión tumoral siguiendo el mismo método descrito anteriormente para cada grupo experimental. A su vez se seleccionaron 16 animales con similares características de tiempo y peso corporal quienes recibieron en ese momento, siguiendo el mismo método, la primera exposición al tumor. Estos animales fueron considerados controles del experimento.

La evaluación de los prendimientos y regresiones tumorales en los diferentes grupos se efectuó durante un período de 31 días. Los resultados son demostrados a través de gráficos confeccionados al efecto.

Para una mayor comprensión de los procedimientos realizados se ofrece el siguiente resumen gráfico:

Dosis: 0,05 ml de suspensión tumoral ajustada volumétricamente
con suero fisiológico a 1:1 y 1:2.

Se seleccionaron 20 ratones de la línea IOR/Hab y 10 de la línea C57BL/6 Hab a los cuales se les inoculó el tumor CETA siguiendo la técnica descrita.

Durante un período de 10 semanas fueron evaluadas las regresiones tumorales. Se realizó además medición de los 2 diamétros principales a fin de determinar los volúmenes tumorales siguiendo procedimiento matemático consignado anteriormente. Los resultados fueron volcados en gráficos consignados al efecto.

Se seleccionaron 25 ratones machos IBF1 a los cuales se les trasplantó CETA , con la particularidad que se cuantificó la suspensión inoculada, realizándose el conteo celular en solución del tripán azul mediante la cámara de Neubauer. De este modo cada animal recibió 2 x 10⁶ Células tumorales que fueron trasplantadas en región femoral izquierda con el objetivo de proteger con mayor facilidad el resto de las estructuras anatómicas en el momento de la irradiación a través de un dispositivo confeccionado en el Instituto Nacional de Oncología y Radiobiología de La Habana, Cuba.

Cada grupo experimental quedó constituído por 5 animales. Se comenzaron a irradiar 9 días después del trasplante con un ciclo de tratamiento compuesto por 5 administraciones (una diaria). Las mediciones de volumen tumoral se llevaron a cabo el día del inicio del tratamiento (valor 0), a las 24 horas después de terminado el ciclo radiante, a los 7, 14 y 21 días. Para su mejor comprensión presentamos a continuación el siguiente resumen gráfico:

Las dosis de irradiación empleadas oscilaron entre 2 y 6 Gray (Gy) en las diferentes series experimentales, administradas por un equipo ROCUS con fuente de irradiación Cobalto 60.

Los cálculos de los volúmenes tumorales y de los índices de inhibición tumoral se efectuaron según procedimientos matemáticos descritos.

DISEÑO EXPERIMENTAL PARA LA EVALUACIÓN DE
LA RESPUESTA DE CETA AL EGFh-recombinante

Se seleccionaron 10 ratones IBF1 machos a quienes se les trasplantó el tumor CETA en región axilar, con la particularidad que se cuantificó la suspensión inoculada, realizándose el conteo celular en solución tripán azul mediante cámara de Neubauer. De este modo cada animal recibió 1 x 10⁶ células tumorales (pase #45-ciclo "in vivo").

El EGFh recombinante fue obtenido en el Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología de Cuba (C.I.G.B). La máxima dosis terapéutica elegida fue de 20mg/Kg de peso. La vía de administración fue subcutánea y las inyecciones diarias durante un período total de 10 días.

Se preparó un grupo control de 10 animales con similar método de siembra tumoral, pero sin tratamiento.

* Para determinar la dósis terapéutica se diseñó inicialmente un experimento de toxicidad crónica.

La evaluación de la respuesta tumoral ante dosis de EGFh-r se realiza sobre la base de curvas de sobrevida.