La fuente de linfocitos a usar en la fusión, depende del esquema de inmunización, el antígeno, los intereses particulares de la investigación, el rendimiento y tipo de inmunoglobulina esperados, e incluso, el tipo de hibridoma a generar. Es frecuente utilizar el bazo donde alrededor del 50% de las células linfoides son del tipo b y donde el número total de células que se obtienen en un ratón inmunizado permite experimentos donde se obtienen gran cantidad de híbridos. Aún así, se han realizado fusiones exitosas con células de ganglios linfáticos, linfocitos de sangre periférica e incluso purificados a partir de tejidos tumorales del hombre(8,35,36).

Los esquemas de inmunización de los animales dependen en gran parte del inmunógeno y el tipo de respuesta deseada. En el esquema se muestra un protocolo para la generación de hibridomas productoras de anticuerpos monoclonales de origen murino(8,9,33,37-40). Con estos sistemas se han producido anticuerpos monoclonales contra haptenos, proteínas celulares, glucoproteínas solubles, polisacáridos y células animales y humanas. Tales procedimientos tienen como ventajas:

v Requieren sólo cinco días;

v Es posible mantener concentraciones definidas del antígeno durante la inmunización;

v Es posible testar el efecto de varias monoquinas y linfoquinas;

v Los cultivos son accesibles al muestreo durante el curso del experimento;

v Es posible producir anticuerpos contra autoantígenos que no son producidos in vivo, debido a supresión o tolerancia. (41)

Una vez inmunizado el animal, las células parentales (linfocitos de bazo y mieloma de cultivo) se centrifugan juntas, se elimina el sobrenadante y se añade el agente fundente (polietilenglicol) de pesos moleculares (desde 1 000 a 6 000), que aglutina las células y modifica la composición fisicoquímica de la membrana, favoreciendo la fusión intercelular. Esta suspensión se diluye en medio de cultivo apropiado y se distribuyen en alícuotas en placas multipozos. El medio utilizado en esta fase de la técnica contiene, además de antibióticos y suero animal, hipoxantina (fuente de purinas), aminopterina (un bloqueador de la vía endógena celular para la síntesis del adn) y timidina (fuente de pirimidinas) en este medio sólo pueden reproducirse las células híbridas, pues el mieloma parental es deficiente de la enzima que permitiría evadir el bloqueo de la vía endógena, aprovechando la fuente de purinas añadida. Entre una a dos semanas ya es posible observar el crecimiento de los hibridomas formando discretas colonias, se procede entonces a eliminar la aminopterina del medio de cultivo para favorecer la proliferación celular y se comienzan a ensayar los sobrenadantes de los pozos, individualmente, en la búsqueda del anticuerpo deseado(41,42).

Existen numerosos procedimientos potencialmente utilizables para detectar la presencia de anticuerpos monoclonales secretados por los cultivos de hibridomas y para, posteriormente, caracterizar su reactividad. Se incluyen entre ellos la inmunofluorescencia indirecta, la microfluoro

metría de flujo, los radioinmunoensayos, las tinciones con inmunoperoxidasa, la formación de rosetas y los inmunoensayos enzimáticos de fase sólida. Este último es uno de los más empleados por su rapidez, posibilidad de automatización, consumo mínimo de muestra y sensibilidad(8,9,38-43). La tendencia moderna es la generación de métodos ultrasensibles pero a la vez sencillos, capaces de procesar simultáneamente y en corto tiempo una gran cantidad de muestras y cuyos detalles dependan del tipo de anticuerpo buscado(44,45).

Una vez localizados los cultivos que secretan el anticuerpo deseado, se realiza el clonaje repetido que asegura su aislamiento y el carácter monoclonal de la preparación. El clon escogido se expande, entonces, en cultivo, y se congela una muestra en nitrógeno líquido para su preservación indefinida y se utiliza el resto para la producción masiva de anticuerpos in vitro o en animales. Si bien en el cultivo, luego de la fusión, la mayoría de los laboratorios emplean medio de cultivo suplementado con suero bovido fetal, caballo o conejo y se utilizan las llamadas "capas alimentadoras" de células (células que no proliferan pero secretan al medio factores estimulatorios de la reproducción de las células b)(33,37,46).

Existe una tendencia creciente a reducir o eliminar el suero por su costo, sustituyéndolo por factores de crecimiento purificados(47). Se ha empleado el sobrenadante de células endoteliales de cordón umbilical humano para suplementar el medio de cultivo y reducir aproximadamente un 50% el consumo de suero fetal bovino, tanto en la siembra de las células recién fundidas, como en el clonaje y expansión de los híbridos obtenidos(48). Algunos laboratorios han logrado diseñar medios químicamente definidos suplementados con factores de crecimiento punficados en los cuales ya es posible crecer algunos hibridomas(47-49).

La producción masiva de anticuerpos monoclonales puede llevarse a cabo como se ha mencionado anteriormente, tanto por el cultivo de los hibridomas y la recogida de los sobrenadantes que contienen los anticuerpos secretados, como mediante la inoculación de las células en la cavidad peritoneal de animales compatibles genéticamente con el linfocito y el mieloma parental (para hibridomas ratón-ratón y rata-rata). Este último procedimiento genera tumores ascíticos cuyos fluídos contienen entre 1-10 mg de anticuerpos por ml (aproximadamente 200-1 000 veces más que la concentración alcanzada en el medio de cultivo)(37,50,51).

Utilizando el método desarrollado por kóhler & mustein se han generado anticuerpos monoclonales contra antígenos de superficie y moléculas secretadas por células de una amplia variedad de tumores (52) . Estos anticuerpos representan un importante paso de avance en el campo de la patología neoplásica, si consideramos los siguientes aportes:

v Mejor conocimiento de la ontogenia y biología de las células tumorales;

v El desarrollo de nuevos métodos de clasificación y diagnóstico;

v El incremento en la especificidad y sensibilidad del monitoreo y localización de la actividad tumoral;

v El desarrollo de la anatomía patológica asociada a la inmunohistoquímica y la generación de esquemas de inmunoterapia antitumoral incomparablemente superiores en especificidad a los empleados en décadas pasadas. (6,52-87)

Luego de los primeros años de aplicación de esta biotecnología, de manera explosiva en la investigación de cáncer se está desarrollando actualmente una tendencia hacia la valoración objetiva de las potencialidades 
de la aplicación de los anticuerpos monoclonales en la oncología, en el marco de los conocimientos científicos actuales(24-30) .

Durante años, en el trabajo de la oncología experimental se ha buscado infructuosamente propiedades de las células tumorales diferentes de las de células normales que permitieran definir un blanco específico para la
terapia antineoplásica(88). Después del entusiasmo inicial sobre el hallazgo de genes que codificaban el fenotipo tumoral en células no manipuladas y las implicaciones que ello podría tener en el conocimiento de los mecanismos de la cancerización celular, la detección de oncogenes en células normales ha originado una corriente más cautelosa de interpretaciones. A pesar de que no existe duda de que los organismos que presentan tumores pueden reconocer a las células tumorales como extrañas y desarrollar respuestas inmunológicas contra ellas(89,90), ha resultado muy compleja la demostración de antígenos exclusivos de las células tumorales "antígenos tumorespecíficos" (ata) con la excepción particular de antígenos asociados a virus oncogénicos. Los supuestos ate han sido detectados también en células y tejidos normales, en parte, gracias a la alta especificidad de los anticuerpos monoclonales generados contra ellos. Actualmente se habla de "antígenos tumorasociados" (ata) para describir estas estructuras moleculares expresadas por las células tumorales y, por el momento, la generación de anticuerpos monoclonales vs. Ata constituye la base de cualquier prueba diagnóstica o terapéutica en cáncer(30,51-83).

1. Marcadores fenotípicos de función celular como los expresados por diferentes subpoblaciones de linfocitos normales y que han permitido la clasificación de leucemias y linfomas(10,11,63) .

2. Antígenos tejidoespecíficos, marcadores de diferenciación restringidos a células maduras. Un ejemplo de ello lo constituyen las inmunoglobulinas mas, sintetizadas exclusivamente por células plasmáticas y que han servido como marcadores o como blanco para el tratamiento a células malignas de esta estirpe(80).

3. Antígenos fetales u oncofetales que como la alfafetoproteína(66) y el antígeno carcinoembriónico(67) se expresan de manera muy restringida por los tejidos normales adultos. Esta diferencia cuantitativa ha sido aprovechada para el desarrollo de pruebas de detección postrat amiento de la actividad de tumores secretores de estos ata.

Además de los mencionados, las células tumorales expresan antígenos de línea, antígenos específicos del estado de desarrollo y maduración celular y antígenos heterotópicos(30). Algunos ensayos terapéuticos con anticuerpos monoclonales en leucemia humana han demostrado también que las células tumorales modulan su expresión antigénica, a ello se añade el hecho de que éstas pueden expresar moléculas incompletas y estructuralmente aberrantes, e incluso no expresen determinados antígenos debido a su enmascaramiento, distorsión o pérdida(28).

Por todos los elementos mencionados anteriormente la estrategia actual del uso de los anticuerpos monoclonales en la oncología se basa en el aprovechamiento de diferencias esencialmente cuantitativas o temporales de expresión antigénica entre los tejidos normales y tumorales, y no en una especificidad estricta. Sin embargo la propia naturaleza de los anticuerpos monoclonales ya ha permitido el desarrollo de procedimientos diagnósticos mucho más sensiblcs que los utilizados antes y la realización de ensayos inmunoterapéuticos exitosos(80).

Debemos señalar, que dentro de la terapéutica del cáncer con anticuerpos monoclonales existen enormes potencialidades a desarrollar como lo es es el acoplamiento de drogas antineoplásicas a los anticuerpos, aprovechando la avidez de estos últimos por el tejido tumoral para la "administración" localizada del producto antitumoral(84,85). Los anticuerpos monoclonales generan también respuestas biológicas en el sistema inmune y además de su posible citotoxicidad directa puede pensarse en la generación de respuestas antitumorales por mecanismos indirectos(86,87).

Por encima de todas las consideraciones, el aporte de los anticuerpos monoclonales a nuestro conocimiento de la biología tumoral, el diagnóstico y terapéutica de los tumores malignos es inmenso y constituye, sin duda, un primer eslabón optimista en el desarrollo de la nueva tendencia del tratamiento del cáncer con reguladores biológicos.