Catarata Congénita Autosómica Dominante

Análisis de Ligamiento Génico Seis Familias Colombianas

Dra. Tania Arguello Sáenz.
Instituto de Genética Humana. Universidad Javeriana, Bogota, Colombia.
Dr. Juan Carlos Prieto Rivera.
Instituto de Genética Humana. Universidad Javeriana, Bogota, Colombia. Hospital Distrital La Victoria
Dra. Marta Lucía Tamayo.
Instituto de Genética Humana.
Universidad Javeriana, Bogota, Colombia. Fundación Oftalmológica Nacional. Bogota, Colombia.

Resumen

Palabras clave: autosómico dominante, catarata congénita, heterogeneidad, ligamiento, lod score,

La catarata congénita es una enfermedad visual caracterizada por presentar alta heterogeneidad clínica y genética, y en la mayoría de los casos hereditarios, sigue un patrón autosómico dominante (CCAD). La caracterización molecular ha identificado más de 20 loci como responsables. En el presente estudio evaluamos seis familias colombianas con CCAD. Cada familia estaba formada por cerca de 20 individuos en 4 generaciones. La catarata presentó variación en densidad y severidad siendo la forma mas común la zonular pulverulenta y la central nuclear. El análisis de ligamiento bipunto se realizó para evaluar cuatro genes responsables de la CCAD localizados en los cromosomas 1, 2, 21 y 22. las regiones específicas fueron analizadas utilizando 12 marcadores polimórficos (D1S514, D1S2669, D1S2721, D2S117, D2S72, CRYGPCR1, D21S1446, D21S171, D21S212, D22S1028, D22S258 y D22S315).

Hemos demostrado ligamiento a dos familias. Una, al cromosoma 1q cerca del gen que codifica para la conexina 50 con valores positivos de lod score para los marcadores D1S514(Zmax=2.74) y D1S2669(Zmax=3.38). Análisis tri-punto dio un Zmax=18.17 a 2max= 0.01, entre estos dos. La catarata muestra una amplia variabilidad intrafamiliar, y la mayoría de los individuos afectados presentaron catarata pulverulenta. En la segunda familia, demostramos ligamiento al cromosoma 21q con valores de lod score positivos para el marcador D21S171 (Zmax=2.64, 2max= 0.1) región en la que se localiza el gen que codifica para la cristalina alfa (CRYAA).

En las familias restantes se excluyó ligamiento del fenotipo con estos marcadores por lod scores negativos. En conclusión, nuestros resultados confirman la presencia de heterogeneidad clínica y genética en nuestra población. Por ello, para dilucidar los mecanismos responsables de la presencia de CCAD, serán necesarios otros estudios futuros de ligamiento génico utilizando marcadores polimórficos, para identificar si el fenotipo de estas familias es debido a un loci ya conocido, o si por el contrario, corresponde a una nueva forma genética aún no descrita.

Introducción

La catarata congénita es una de las causas más comunes de anomalías oculares y ceguera en la infancia. La catarata puede presentarse de manera asilada o haciendo parte de un síndrome genético. Aproximadamente un tercio de los casos son aislados, siendo la catarata congénita autosómica dominante (CCAD) la forma más comúnmente heredada.

Esta enfermedad es clínica y genéticamente heterogénea. Varios tipos clínicamente similares han mostrado ser genéticamente diferentes, mientras que otros han sido ligados genéticamente7. Actualmente han sido identificados 20 loci diferentes en humanos como responsables de diferentes tipos morfológicos de CCAD. Estos incluyen 7 genes que codifican para proteínas de tipo cristalinas (CRYAA, CRYAB, CRYBA, CRYBB, CRYGE, CRYGC, CRYGD)1,7,8,9,10, 2 para genes de tipo conexina (GJA8, GjA3)6,14, una para el gen regulador (PITX3)6, uno para proteínas estructurales tipo beaded-filament, (BFPS-2)2 y una para proteínas intrínsecas de membrana(AQPO)5.

Identificamos seis familias colombianas con CCAD que presentaban una amplia variación fenotípica. Realizamos análisis de ligamiento con 12 marcadores microsatélite localizados en 4 regiones cromosómicas, 1q22-23, 2q33-35, 21q22.3 y 22q11.2-12.2 donde han sido identificados 4 genes responsables de la CCAD9,10,12,14. En dos familias se demostró ligamiento a loci descritos previamente en la literatura, y en otra familia, los valores de lod score ligeramente positivo para un marcador no permitieron excluír completamente la región cromosómica 1q, mientras que para las otras familias fueron excluidos todos los marcadores para estas regiones estudiadas.

Pacientes y Métodos

Estudiamos 6 familias de 167 individuos, dentro de los que se encontraban 96 afectados y 71 parientes sanos. Las familias provenían de un estudio epidemiológico anterior en las que se logró definir un patrón de herencia autosómico dominante 15.

La selección de familias se realizó teniendo en cuenta aquellas que tenían un mayor número de sujetos afectados por generación y que fueran lo suficientemente informativas para realizar los estudios de ligamiento. A todos los sujetos estudiados se les realizó una completa valoración oftalmológica y todos firmaron el consentimiento informado para participar en el estudio.

Genotipificación

El DNA genómico fue extraído a partir de muestras de sangre periférica tomadas con el sistema VacutainerÒ con EDTA y siguiendo la extracción con la técnica de fenol-cloroformo. A las 6 familias seleccionadas se les realizaron los estudios de ligamiento utilizando tres marcadores polimórficos para cada uno de los cromosomas: D1S2669, D1S514, y D1S2721 para la región cromosómica 1q21; D2S72, D2S117 y CRYG1 en 2q33-35; D21S1446, D21S171 y D21S212 en la región 21q22.3; y CRYBB2 (D22S1028), D22S258 y D22S315 para la región 22q11.2-q12.2, en los cuales se han descrito mutaciones específicas en genes responsables de la catarata congénita autosómica dominante en otras poblaciones.

El genotipo para cada microsatélite fue determinado por amplificación del DNA genómico con primers sintéticos en volúmenes de amplificación de 25 o 10:l de reacción en tubos de pared delgada de 0.2ml utilizando el termociclador (BIO-RAD â). En cada tubo de reacción se utilizó una concentración de 0.5pM de cada uno de los primers (forward y reverse), una concentración final de 4:M de dNTPs (dATP, dCTP, dGTP y dTTP), 0.25- 1.25mM de MgCl2, 1X de Buffer para PCR 10X ( 166mM (NH4)2SO4, 670mM Tris.HCl, pH 8.8), 1.5 unidades (U) de Taq polimerasa (Perkin Elmerâ) 5-10% dimetilsulfóxido (DMSO) y aproximadamente 20ng de DNA genómico.

Los productos de amplificación fueron visualizados en geles denaturantes de poliacrilamida al 6% u 8% [Acrilamida-N,N-metilenbisacrilamida (entrecruzamiento variable), Buffer TBE 1X (Tris base, ácido bórico, EDTA); Persulfato de amonio 10%; TEMED; Urea 7M]. Se corrieron por electroforesis en una cámara de secuenciación (GIBCO) de 38x40cm con buffer TBE 1X a temperatura constante (50ºC), y a 45W constantes de poder durante aproximadamente 3-6 horas. Se utilizó el marcador de peso molecular ØX174 para determinar el tamaño de los fragmentos. El gel obtenido fue procesado con la técnica de coloración de plata según lo descrito por Caetano-Anallés G3.

Análisis de Ligamiento

El análisis de ligamiento de dos puntos se realizó utilizando el programa MLINK de LINKAGE. Se consideraron parámetros del fenotipo de la catarata tales como herencia autosómica dominante, frecuencia alelica de la enfermedad de 0.0001 y penetrancia completa. Los valores de recombinaciòn (2) se tomaron iguales, tanto para hombres como para mujeres, así como también las frecuencias alélicas para cada uno de los marcadores analizados. Las características especificas utilizadas para cada uno de los marcadores se tomaron a partir de la información proporcionada por el GDB (Genome Data Base).

Resultados

Evaluación Clínica

Se identificaron cuatro fenotipos en las seis familias analizadas. La catarata presentó variabilidad tanto en morfología como en severidad a nivel Inter e intrafamiliar y en algunos casos interocular. FAMILIA 9CC: Amplia variedad morfológica con opacidades limitadas al núcleo fetal y embrionario del cristalino; clasificada como zonular pulverulenta y nuclear. FAMILIA 12CC: Catarata clasificada como zonular pulverulenta con gran variabilidad interindividual e interocular. FAMILIA 13CC: Opacidades nucleares fetal y embrionarias, y/o opacidades centrales pulverulentas; clasificada como catarata tipo zonular central nuclear. FAMILIA 33CC: La morfología de la catarata se caracterizó por ser bilateral y de expresividad variable; clasificada como zonular central nuclear. FAMILIA 35CC: Opacidades ubicadas en la región subcapsular posterior, prolongadas a manera de cuatro cruces hacia las suturas en Y del cristalino; clasificada como zonular lamelar. FAMILIA 37CC: Opacidades únicamente en la región polar posterior del cristalino, variables en tamaño entre los diferentes individuos con una morfología característica que semeja anillos de cebolla; clasificada como polar posterior. (Ver tabla No.1)

Análisis de Ligamiento

Se excluyó ligamiento con valores de lod score nevativos para todas las cuatro regiones cromosómicas estudiadas en tres familias (9CC, 35CC y 37CC) y se incluyó ligamiento con valores positivos en dos familias (12CC y 13CC). La familia 12CC mostró ligamiento positivo para dos marcadores ubicados en la región cromosómica 1q22-23. Se obtuvo un valor de lod score de ZMAX =2,74 a 2 MÁX=0,0 con el marcador D1S514 y ZMAX =3,39 a 2 MÁX.= 0,0. con el marcador D1S2669. Con un análisis tri-punto entre estos dos marcadores se obtuvo un lod score ZMAX =18,17 a una fracción de recombina

ción 2MAX=0,0 (ver tabla 1). Estos resultados confirman que la localización de la catarata zonular pulverulenta en esta familia esta localizada en la región cromosómica 1q muy cercano al locus GJA8 que ha sido reportado como responsable de este mismo fenotipo en otras poblaciones. El análisis de haplotipos mostró que el fenotipo de la enfermedad se segrega con el haplotipo 1, 2, 3, para los individuos afectados. En este análisis se observaron dos eventos de recombinación para los individuos 12CC2 Y 12CC6 con el marcador mas distal D1S2721, ubicando al locus de la catarata a una distancia de 1.3 cM desde el marcador D1S2669.

Para la familia 13CC, En el cromosoma 21, el marcador D21S171 mostró un valor de lod score máximo ZMAX= 2.64 a un 2MÁX.= 0.1, lo que sugiere la presencia de ligamiento para esta familia a la región cromosómica 21q22.3 a pesar de la poca informatividad que presentaron los otros marcadores localizados en esta región. Se excluyo ligamiento a las regiones cromosómicas 1q22-23, 2q33-35 y 22q11.2-12.2.

El análisis de ligamiento en la familia 33CC excluyó tres regiones cromosómicas (2q33-35, 21q22.3 y 22q11.2-12.2). Sin embargo, el análisis de ligamiento realizado en la región cromosómica 1q22-23, mostró valores ligeramente positivos para el marcador D1S514 (ZMAX =1.79 a qMAX= 0.1).

No, de familias	No. individuas estudiados		Diagnnóstico clínico. Tipode catarata	Análisis de ligamento genético			Gen candidato
	Total	Afectados		regiones exclidas	Regiones incluidas	Lod score (Z)
9CC	42	28	Zonular pulverulenta y nuclear	1q22-23 2q33-35 21q22.23 22q11.2-12.2			GJAB (CX50)
12CC	20	7	Zonular central nuclear	1q22-23 21q22.23 22q11.2 -12.2	1q22-23	Zmax=18.17(1)	CRYAA
13CC	34	17	Zonular central nuclear	1q22-23 21q33.3522q11.2 -12.2	21q22.23	Zmax=2.64
33CC	26	17	Zonular central nuclear	2q33-35 21q22.23 22q11.2 -12.2	* indeterminado 1q22-23 Zmax=1.74 (2)
35CC	6	4	Zonular lamellar	2q33-35 21q22.23 22q11.2 -12.2
37CC	39	23	Polar posterior	1q22-23 2q22.23 21q21.3 22q11.2-12.2