1. Para la extracción y purificación del RNA total se partió de parásitos en estadio de trofozoítos maduros y esquizontes, dado que la síntesis de RNA total durante el ciclo asexual del Plasmodizrm falcipawm presenta las más altas tasas en esos estadios. (4) Las células son lisadas con isotiocianato de guanidina, se solubhza el tejido y las proteínas pasan de su estado nativo a desnaturalizado. Se usan detergentes no iónicos como el sarkosyl porque lisan la membrana plasmática, conduciendo a un ácido nucleico intacto. Se hace homogenización de la mezcla para favorecer la separación de RNA en la ultracentrifugación el cual es separado del DNA y proteínas, en un cojín de cloruro de cesio, dada su mayor densidad con respecto al DNA. En general este método permite la extracción de un RNA La mayor dificultad en la extracción del RNA es evitar la contaminación con RNAsa, enzima muy estable que no requiere cofactores para su función. Por lo tanto, se deben tratar las soluciones y los materiales con 0,1% (v/v) de dietilpirocarbonato, DPC, el cual inactiva las ribonucleasas por modificación covalente.(6)

Para el RNA de Piasmodium la relación de absorbancias a 260 y 280 nm, es de 2,3.q,') Esta relación se utilizó como parámetro que permitió evaluar parcialmente la calidad del RNA total extraído. En este trabajo se aislaron desde 265,4 hasta 780 pg de RNA total a partir de los parásitos.

2. La separación del mRNA se hizo mediante una cromatografia de afinidad en columnas de oligo-dT celulosa y sepharosa 4B-poli U. Para el Plasmodizlm falciparum el 82% del RNA total es ribosomal, aproximadamente el 14% es tRNA y una proporción muy pequeña 2-5% es mñNA. Usualmente con la cromatografía de afinidad se recupera entre el 1-2% del RNA total como mensajero.(')Por esto, en este procedimiento, al igual que para la extracción del RNA total, fue crítica la eliminación y la prevención de la contaminación con RNAasas. Se utilizaron dos matrices, una de oligo dT; y otra de sepharosa 4B poli U, con esta última se obtuvieron los mejores rendimientos de extracción y por eiio se utilizó en lo sucesivo.

Figura 2. Método de Gubler y Hoffman

En general, la matriz de oligo dT, forma complejos dT-poli A con soluciones bufler de alta fuerza iónica, por lo tanto su capacidad de enlace depende de la concentración de la sal utilizada, además del tipo de catión de la sal, la presencia de detergentes y la fuente de la celuiosa. La elución del mRNA se hizo con soluciones bufer de baja fuerza iónica lo que desestabiliza los pares de bases híbridos. La ventaja del uso de esta matriz es que es resistente a nucleasas e hidrólisis alcaiina y su capacidad de enlace es mayor que la de la sepharosa 4B poli U. Igualmente, no se requieren agentes desnaturalizantes o altas temperaturas para la elución de la muestra, sin embargo, en el primer experimento utilizando esta matriz, la elución del mRNA se hizo con solución buffer de elución a temperatura ambiente, para el segundo experimento se hizo con esta solución a 65°C con el fui de favorecer la separación de las cadenas de RNA pohA con el oligo dT de la matriz además de la disminución de la fuerza iónica aportada por la solución buffer de elución. A pesar de que en la literatura hay referencia de que la elución no requiere agentes desnaturalizantes y/o altas temperaturas), se observó que el rendimiento aumentó tres veces con respecto al anterior. Sin embargo, con el ánimo de comparar rendimientos, se realizó una cromatografía utilizando sepharosa 4B poliU. Se realizó un tercer experimento en el cual se obtuvo un rendimiento del 4%,superior al reportado en la literatura; para este experimento se hizo control electroforético sobre un gel de agarosa l%/TBE yno se evidenció presencia de RNA ribosomal. En lo sucesivo se utilizó esta matriz.

4. Resultados electroforéticos de la síntesis de primera y segunda cadena de cDNA. Al comparar los tamaños del CDNA a partir del m A , (Figura 3) se observó síntesis en un rango de 564-5900 pb para el cDNA de cadena sencdla,  y de 564-4200 pb para el cDNA de cadena doble. Para el caso del cDNA a partir de RNA total, el tamaño entre la primera y segunda cadena se conservó (rango de 564-23000 pb); sin embargo, al comparar la síntesis obtenida a partir de los dos materiales de partida, el rango fue más amplio en el caso del RNA total. Vale la pena anotar que estos resultados fueron reproducibles en tres experimentos realizados. Por otra parte, para el cDNA-mRNA control cs y cd, se evidenció una banda de 1,2 Kb, acorde con lo esperado. También se observó una banda de bajo peso molecular (menor de 500 pb), en la cual la literatura reporta, que corresponde a un anillaje aberrante del iniciador- mRNA que influye directamente en la síntesis de cDNA más cortos."