Modelos de estudio

El estudio de desórdenes genéticos complejos es un reto para los investigadores en esta área ya que, como resultado de sus causas complejas y multifactoriales (componentes ambientales y genéticos) (4,7,15-16), estos desórdenes tienen numerosas características que afectan el diseño de estudios genéticos por varias razones: en primer lugar es un desorden heterogéneo, es decir, más de un gen puede influenciar la susceptibilidad, y en diferentes familias la susceptibilidad puede ser debida a diferentes combinaciones de genes que originen esta condición; por otra parte, no todos los individuos con genotipo susceptible desarrollan la enfermedad. Adicionalmente, la definición del fenotipo en todos los miembros de la familia es a menudo un elemento complejo debido a la variación en la expresión de la enfermedad en diferentes individuos de una misma familia. Por último, los efectos de las interacciones ambientales son desconocidos (3,7).

Una forma de abordar el estudio genético de este tipo de desórdenes es encontrar alelos marcadores que se cohereden con el gen o los genes que originan la enfermedad. Dado que el genoma humano posee alrededor de 3 billones de pares de bases (pb), uno o más alelos que impartan susceptibilidad estarían segregándose en las familias con individuos afectados. De acuerdo con los principios mendelianos, cuando un alelo marcador y un alelo que confiera susceptibilidad están muy separados en el mismo cromosoma o están en cromosomas diferentes, éstos se segregarán en forma independiente y el alelo marcador aparecerá con igual frecuencia en individuos afectados y no afectados de la misma familia. Sin embargo, si el alelo marcador se encuentra muy cerca al alelo de susceptibilidad en el mismo cromosoma, el marcador y el gen de la enfermedad se segregarán conjuntamente en la familia, proporcionando evidencia para ligamiento. De esta manera, el alelo marcador se encontrará con mayor frecuencia en los miembros de la familia afectados que en los no afectados. Si este patrón de co-segregación está presente en muchas familias o en parientes relacionados afectados, esto constituirá evidencia de ligamiento.

En estudios de ligamiento generalmente se emplean secuencias de ADN de 2, 3 ó 4 pb que se repiten en forma consecutiva a través del genoma. Estos marcadores se denominan polimorfismos repetitivos cortos consecutivos (STRPs). El número de repeticiones de los STRPs puede variar considerablemente en un locus particular de un cromosoma a otro. La razón por la cual estos STRPs se usan en este tipo de estudios es porque permiten identificar marcadores en cromosomas parentales específicos para cada descendencia. Otra característica de estos marcadores es que son muy abundantes en todo el genoma. El uso de STRPs implica conocer su localización; por consiguiente, la co-segregación (o ligamiento) de un fenotipo de la enfermedad con un STRP indica que el locus de susceptibilidad está relativamente muy cercano al locus marcador en el cromosoma. Una vez establecido el ligamiento de ambos marcadores, se hacen algunos estudios adicionales en dicha región con el fin de refinar la localización del locus de la enfermedad y eventualmente esto posiblemente conduzca a la identificación del gen de la enfermedad. Hasta la fecha se han reportado muchas regiones cromosómicas ligadas a asma bronquial, pero aún no se han identificado genes específicos para esa entidad (3,7,35).

Los estudios de genética del asma básicamente se han desarrollado a partir de tres enfoques: el primero involucra el uso de genes candidatos para realizar estudios de ligamiento o asociación en familias o poblaciones de pacientes con el fin de establecer si dichos genes están involucrados en la enfermedad (22,24,36-38). Un segundo tipo de estudio tiene como objetivo identificar asociaciones funcionales y estructurales con polimorfismos o mutaciones en el ADN o en la estructura proteica, o en las regiones promotoras de genes candidatos. Este tipo de estudio está orientado a develar los mecanismos de la patofisiología del asma y la atopia y así utilizar la información como blanco para una futura terapia génica (39). Una tercera aproximación para estudiar la genética del asma bronquial es usar marcadores microsatélites del ADN asociados con ligamientos a lo largo de todo el genoma. Con esta clase de estudio se han logrado reportar e identificar múltiples ligamientos dentro del genoma, cada uno de los cuales puede estar asociado con genes candidatos que podrían ser relevantes dentro de la entidad (17,39-40).

Análisis de ligamiento

El análisis de ligamiento usa principalmente los datos familiares para seguir la transmisión de la información genética entre generaciones. Esta información permite determinar si un marcador está ligado a un gen involucrado en una enfermedad en particular, en este caso el asma bronquial. La aplicación del análisis de ligamiento paramétrico para enfermedades complejas ha tenido algunas complicaciones debido a la heterogeneidad genética y a la dificultad de definir un modelo genético específico para el fenotipo de la enfermedad. Los análisis paramétricos son una estrategia muy adecuada cuando se conoce el modelo, pero cuando se trata de rasgos complejos en los cuales el modelo es difícil de discernir (41), esta aproximación resulta inapropiada. Sin embargo, es muy adecuada para maximizar el logaritmo de LOD (LOD score) de numerosos modelos para detectar ligamiento y determinar los parámetros del modelo de herencia. Con el reciente desarrollo de análisis no paramétricos eficientes y múltiples estrategias (42) ha sido posible asumir el reto de identificar un loci para una enfermedad compleja como el asma. Estas estrategias incluyen modelos con hermanos o miembros afectados con el fin de ver regiones del genoma compartidas (43-45). Esta estrategia se ha convertido en una aproximación exitosa debido a la posibilidad de genotipificar automáticamente un vasto número de individuos, permitiendo así la identificación de posibles loci de la enfermedad. No obstante, los análisis no paramétricos no tienen la capacidad de proporcionar la distancia genética, contrariamente a los análisis de ligamiento paramétricos, los cuales son capaces de estimarlas.

Desequilibrio de ligamiento (DL) 

Otra aproximación del mapeo genético es medir el DL entre un marcador y la enfermedad, usando una población de individuos afectados  e individuos control o un grupo de familias nucleares. Esta estrategia permite refinar la localización de un gen y está basada en la identificación de correlaciones no aleatorias entre alelos presentes en dos loci en una población (7,18). Por ejemplo, en un sistema de dos marcadores, donde cada uno de ellos tiene dos alelos, existiría la misma probabilidad de que un alelo del primer locus esté asociado con 1 ó 2 alelos del segundo locus. Sin embargo, si la recombinación entre ellos es poca o no ha pasado el tiempo suficiente para que se de este evento, entonces es posible que exista DL. Esto significa que un alelo del primer locus puede estar asociado con el alelo 2 en el segundo locus. Por otra parte, el LD puede ser causado por un “efecto fundador” (7). En general, se asume que la recombinación es el principal determinante para que exista DL. De esta forma, en distancias génicas muy cortas este DL puede incrementarse. En general se acepta que el LD puede detectarse en distancias de hasta 1 cM ó 1000kb. Sin embargo, El DL se ha detectado en distancias tan grandes como 21 cM y 5,7 Mb, aunque no hay una correlación constante entre DL y distancia.

El DL puede usarse también para mapeo de loci involucrados en la enfermedad y tiene una mayor eficacia que las estrategias de ligamiento cuando se aplica en enfermedades complejas sobre todo cuando se trata de refinar el mapa genético (43). El DL ha sido propuesto como una herramienta útil para el mapeo fino de loci de enfermedades (46). El  DL disminuye las distancias que están lejos del lugar de la mutación y aumenta a distancias cercanas;  se aplica idealmente cuando existe una mutación homogénea, es decir, todos los individuos afectados comparten la misma mutación. Sin embargo, el DL también puede aplicarse en enfermedades heterogéneas asumiendo que una proporción detectable de la población tiene una mutación proveniente de un ancestro que igualmente la compartía. El DL fue usado para hacer un mapeo fino del locus de la ataxia de Friedreich e identificar el gen responsable de la enfermedad (47). Además, se ha usado para facilitar la comprensión de la etiología de numerosas enfermedades, entre ellas el asma bronquial (48).

El uso del DL en el mapeo génico de una enfermedad requiere de un grupo control para efectos comparativos. El DL observado puede ser explicado ya sea porque existe una verdadera asociación con la enfermedad o porque hay una diferencia inherente entre el caso y la población control, de tal forma que el DL pueda detectarse entre ellos para varios loci. Se han desarrollado enfoques alternativos que permiten utilizar el genotipo de los progenitores. Una de estos es el denominado control basado en familias afectadas, el cual tabula los genotipos parentales en alelos que han sido transmitidos o no al niño afectado (49). Con este modelo se evalúa si hay una diferencia significativa entre todos los alelos que han sido o no transmitidos usando una tabla de contingencia 2Xn probada a través de un análisis de Chi-cuadrado. No obstante, este tipo de prueba pierde potencia cuando el equilibrio de Hardy-Weinberg  no está presente (50-51).

La presencia de DL y de ligamiento indica que un locus principal está muy cerca a esa región, mientras que el DL sin ligamiento indica que el locus es un factor de susceptibilidad. La interpretación de los datos toma en consideración la capacidad de detectar ligamiento para poder discriminar entre un locus principal o uno que confiere susceptibilidad.

El DL también puede ser el resultado de mezclas recientes de poblaciones genéticamente divergentes (52-54). En teoría un alto grado de DL entre dos genes separados por 10-20 cM pueden originarse y persistir en poblaciones que tienen una historia reciente de mezcla (3-20 generaciones), tal como ha ocurrido en poblaciones hispánicas, incluyendo la población antioqueña que rodea a la ciudad de Medellín (55). Esto puede detectarse con varios análisis incluyendo, mapeo por desequilibrio de ligamiento (53) o por la prueba  de desequilibrio/transmisión (54,56-57) para mapear genes con l’s > 3,0 a través de un barrido amplio del genoma usando un mapa de 10 cM basado en tamaños muestrales (100-800 tríos).

Se ha demostrado que los bancos de ADN pueden usarse exitosamente para medir frecuencias alélicas, en un banco ADN con un número de muestras entre 26-1350 y efectuar el mapeo para DL (17) (58-59). Así, el DL puede usarse tanto para hacer un barrido amplio del genoma como para hacer un mapeo fino de un loci sugerido por un barrido inicial.