Revisión de temas

Regulación de la localización de las proteínas de choque
térmico (HSP70s) por citocinas en la línea tumoral K562

Barreto A.1, Barrera G. 2, González J.M. 1 y Fiorentino S1.
1 Grupo de Inmunobiología y Departamento de Microbiología, Facultad de Ciencias, Pontificia Universidad Javeriana, Bogotá.
2 Unidad de Microscopía Electrónica, CORPOICA, Bogotá.
Correo electrónico: alfonso.barreto@javeriana.edu.co

Las proteínas de choque térmico (HSPs), reconocidas por su función de chaperona molecular, se han asociado recientemente en procesos de comunicación intercelular en condiciones normales, y bajo ciertas condiciones parecen actuar como señales de peligro que activan el sistema inmune. Las HSPs se movilizan constantemente en el interior de la célula y su localización determina su función. Sin embargo, los mecanismos que participan en este proceso no han sido bien establecidos. En este trabajo se evalúo el efecto de la IL-10 e IFN-g en la síntesis y localización celular de las proteínas HSP70 (inducible) y HSC70 (constitutiva) sobre la línea tumoral K562. La síntesis y localización de la proteína constitutiva e inducible en las células K562 tratadas con los diferentes estímulos, fueron analizadas por western blot (WB), citometría de flujo (FACS) e immunomicroscopía electrónica (IME). Los análisis por WB a partir de extractos de células cultivadas a 41.8°C durante 3horas 20 minutos y a 37°C por 3 horas, o tratadas con 750 U/ml de IFN-g, 10 ng/ml de IL10 o 1 uM de MG132, muestran un incremento de los niveles de HSP70 pero no de HSC70, en respuesta a todos los estímulos. Utilizando FACS, se determinó una disminución de la HSC70 en la membrana plasmática en respuesta al tratamiento con choque térmico o con IFN-g. En contraste, la proteína inducible no presentó cambios notables en la membrana, pero se observó una localización preferencial en el núcleo luego del tratamiento con choque térmico o con IFN-g. La síntesis y localización de HSP y HSC70 parecen estar reguladas por mecanismos diferentes. El aumento en la localización nuclear de HSP70 podría estar asociado con una función protectora, como ha sido descrito. La disminución de la HSC70 presente sobre la superficie celular podría indicar su liberación (chaperoquina) o internalización (chaperona).

Revisión de temas

Uno de los efectos colaterales más comunes en pacientes con síndrome convulsivo es el sobreagrandamiento gingival (SAG) secundario al consumo de fenitoína. Aproximadamente el 50% de los pacientes que consumen este medicamento presentan esta patología gingival. Por lo anterior se han definido dos categorías: «respondedores» para aquellos que desarrollan el SAG y «no respondedores» para quienes no lo presentan. Diversos estudios han implicado al fibroblasto gingival como la célula central en la patogénesis del SAG; no sólo por producir proteínas de la matriz extracelular (MEC) sino también por sintetizar enzimas involucradas en la degradación de la misma. En este proceso metabólico han sido involucrados algunos factores de crecimiento y citocinas como: IL-1a, TGF-b y TNF-a. Estas citocinas participan en procesos como la inducción de la síntesis de proteínas de la MEC o en el control de su degradación. El objetivo de este estudio es evaluar la presencia de los receptores para IL-1a, TGF-b y TNF-a en fibroblastos gingivales humanos (FGH) provenientes de individuos sanos y de pacientes con SAG secundario al consumo de fenitoína. FGH fueron obtenidos por explantes de tejido gingival, previo consentimiento informado. Las células fueron mantenidas durante los pases sucesivos en MEM y suero fetal bovino al 10%. Los cultivos fueron seguidos por microscopía de luz para determinar su morfología. Se evaluó la expresión de marcadores como vimentina y CD14 por citometría de flujo. La evaluación de los receptores en superficie se realizó incubando los FGH con la citocina respectiva marcada con biotina y posteriormente adicionando el conjugado avidina-fluoresceína, para ser leídas por citometría. Los resultados muestran que los cultivos de FGH después del 4 pase presentan células con morfología típica alargada y con prolongaciones. Estas células fueron positivas para vimentina en citoplasma y CD14 en superficie. Los FGH de pacientes con SAG presentaron mayor tamaño y una expresión más marcada del receptor para TNF-a comparados con los FGH de individuos sanos y no respondedores. La expresión de receptores para IL-1a y TGF-b no mostró diferencias entre los pacientes. Nuestros resultados demuestran que hay características morfológicas y fenotípicas diferenciales en los FGH de los pacientes con SAG secundario al consumo de fenitoína. La presencia de los receptores para TNF-a indica que esta citocina juega posiblemente un papel importante en el desarrollo de esta patología. Ha sido demostrado que el TNF-a interviene en la síntesis y degradación del colágeno, así como en la proliferación de los fibroblastos.

Unión y estabilidad del complejo cmh/péptidos, provenientes de proteínas conservadas de los cuatro serotipos del virus del dengue

Rodríguez V.1, Bonelo A.2, Herrera S.2, González J.M.1
1 Departamento de Microbiología y Grupo de Inmunobiología, Facultad de Ciencias, Pontificia Universidad Javeriana,
Bogotá
2 Instituto de Inmunología, Universidad del Valle, Cali.
Correo electrónico: vivianar@javeriana.edu.co

Desde la descripción en 1991 por Falk y sus colaboradores de las secuencias de anclaje presentes en los péptidos con potencial de unión a moléculas del Complejo Mayor de Histocompatibilidad (CMH), se ha aplicado esta técnica de "inmunología reversa" para la selección de posibles epítopes inductores de la respuesta de linfocitos T. En la actualidad, para la selección de epítopes citotóxicos no solamente se utilizan péptidos con longitud adecuada (9 a 10 a.a.) y la presencia de los sitios de anclaje (L/M posición 2 y V/L posición 9 ó 10 para HLA-A*0201), si no que también se tiene en cuenta la presencia de residuos que favorecen o desfavorecen el anclaje e igualmente su posible sitio de corte por el proteasoma. En este estudio se selecionó el modelo de virus del dengue para estudiar la respuesta T CD8+, ya que se conoce poco el papel de la respuesta inmune celular. El objetivo general es determinar la presencia de secuencias peptídicas cortas derivadas de proteínas de los cuatro serotipos del virus del dengue como potenciales epítopes citotóxicos. Se seleccionaron las secuencias de cuatro cepas prototipo del virus del dengue: Cepa Singapur-1, Cepa Jamaica-2, Cepa-3 y Cepa-4, se buscaron motivos de unión para la molécula de clase I : HLA-A*0201 y sitios de clivajes proteasómicos. Se sintetizaron 8 péptidos de 9 a.a. provenientes de la Helicasa (NS3), Polimerasa (NS5), Envoltura (E). Los péptidos virales sintéticos fueron evaluados in vitro para determinar su unión y estabilidad a moléculas de HLA-A*0201, utilizando la línea celular lifoblastoide denominada T2. Posteriormente, la expresión en superficie del complejo péptido-HLA se determinó por medio de citometría de flujo con la ayuda de un anticuerpo que reconoce el dominio alfa-3 de la molécula de HLA-A2. Seis péptidos seleccionados no mostraron unión a moléculas de HLA-A*0201 en la línea celular T2 en comparación con el péptido MP-Flu 58-66, péptido reconocido epítope para este subtipo del HLA-A2.Dos péptidos presentaron una afinidad relativa de unión a moléculas de HLA-A*0201 de 0.25 y 0.62; con una estabilidad de los complejos de 5 horas y 3 horas respectivamente. Interesantemente, a pesar de que los 8 péptidos mostraron los motivos de anclaje, sólo 2 péptidos presentaron unión al CMH. Estos resultados implican que probablemente las secuencias conservadas no son presentadas y por tanto no inducirían respuesta celular, lo cual sería otro posible mecanismo de evasión de la respuesta inmune por parte de los virus. La capacidad de estas secuencias de inducir linfocitos T CD8+ será evaluada por medio de ELISPOT para IFNy.

Revisión de temas

Marques Sandra1, Veyrune Jean-Luc1, Shukla Ram1, Urcuqui Silvio2, Kumar Ajit1, Velilla Paula2-3
1 Centro Médico Universidad George Washington
2 Grupo de inmunovirología-Biogenesis Facultad de Medicina Universidad de Antioquia
3 Bacterióloga, Joven Investigador de Colciencias
Correo electrónico: usilvio@medic

Entre los obstáculos que existen para entender la infección y la respuesta inmune por el HIV-1 es la ausencia de modelos animales que permitan estudiar la patogénesis del SIDA. Modelos murinos han sido desarrollados, pero carecen de replicación productiva a largo término, debido a que la glicoproteína de envoltura de HIV-1 no se une al receptor CD4 ni al correceptor CCR5 murino o porque la transcripción directa del LTR de HIV-1 es ineficiente debido a una actividad atenuada de Tat, que es rescatada por la ciclina T1 humana. La coexpresión de CD4, CCR5 humanas en el cultivo de las células murinas permiten la entrada del virus sin viremia detectable. En animales transgénicos que expresan la ciclina T1 se observa un bloqueo post-transcripcional que afecta la replicación. Teniendo en cuenta que Rev es fundamental en el ciclo replicativo de HIV-1, un bloqueo de su actividad explicaría la ausencia de replicación del virus en las células murinas.

Evaluar y caracterizar el dominio de Rev implicado en el bloqueo de la replicación del HIV 1 en las células murinas.

Las células A9 se cotransfectaron con las construcciones pRSVRev, pRSVRev1-79, pRSVCRev, pRSVRex79-95, y el gen reportero pCMV128, para determinar el dominio de Rev implicado en el bloqueo de su función. Por microscopía confocal se determinó la localización de Rev.

Se demuestra que en las células A9 la función de Rev está restringida, pero es recuperada utilizando la proteína Rev-Rex o pRSVCRev con Rev, sugiriendo que el dominio C-terminal es importante. Nuestros resultados muestran que Rev se localiza en el citoplasma después del tratamiento de las células A9 con cicloheximida y actinomicina D.

Nuestros resultados sugieren la existencia de mecanismos diferentes a la exportación implicados en la disminución de la replicación viral, que podrían estar asociados a modificaciones post-transcripcionales que involucren inestabilidad de Rev o degradación de transcriptos virales en el citoplasma del huésped. Determinar la naturaleza de los factores del huésped murino responsable del bloqueo funcional de Rev son fundamentales para el desarrollo de un modelo murino.

Revisión de temas

Antigenicidad de las proteínas recombinantes pvs25 y pvs28 de plasmodium vivax

Cifuentes C.1, Stowers A.2, Herrera S.1
1 Instituto de Inmunología, Universidad del Valle.
2 National Institute of Health, MVDV. United States.

Las vacunas bloqueadoras de la transmisión (TBVs) son una estrategia para el control de la malaria, mediante la cual nuevos ciclos sexuales en el mosquito son inhibidos por anticuerpos humanos dirigidos contra antígenos presentes en esta fase de desarrollo del parásito. Las moléculas blanco de una TBV son aquellas expresadas por los estadios sexuales de los parásitos (gametocitos, gametos, cigotes, ooquinetos, ooquistes) o por los órganos digestivos del mosquito. Las proteínas del ooquineto de P. falciparum PfS25 y PfS28 se han propuesto como candidatos a vacuna muy promisorios. En P. vivax se ha logrado clonar sus proteínas análogas PvS25 y PvS28. El objetivo del presente trabajo es evaluar la antigenicidad experimental y natural de las proteínas del ooquineto PvS25 y PvS28 en habitantes de regiones de Colombia endémicas para malaria y en monos previamente infectados con Plasmodium. Veinte muestras de humanos naturalmente expuestos a la infección y veinte muestras de monos infectados con P. falciparum y veinte con P. vivax fueron analizadas para determinar la presencia de anticuerpos contra estas proteínas utilizando el método de ELISA. Este estudio demostró que las proteínas PvS25 y PvS28 son reconocidas por sueros de habitantes de zonas endémicas para malaria. Igualmente, se detectó respuesta de anticuerpos contra estas proteínas de estadios esporogónicos en monos Cebidae infectados experimentalmente con esporozoitos y formas sanguíneas de P. falciparum, P. vivax. Interesantemente, se observó reconocimiento cruzado entre estas dos especies de Plasmodium ya que las proteínas de P. vivax fueron reconocidas por sueros de monos infectados con P. falciparum.