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aRTÍCULOS
CIENTÍFICOS
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Viabilidad celular in vitro de tejido renal neonatal postmortem: sus aplicaciones futuras
*Académico
Álvaro Dueñas
L.; Doctor Rodrigo Cifuentes
B.;
Licenciado William David Criollo; Licenciada
Ana Julia
Miranda ded
Bernal; *De los departamentos de
Microbiología y Programa IN-VITRO (A.
Dueñas, MD, MPH, TM, W. D. Criollo,
Bact. y A. De Bernal, Trab. Soc.) y
Ginecología y Obstetricia
(R. Cifuentes, MD, PhD), Facultad de Salud,
Universidad del Valle y Hospital
Universitario del Valle, Cali, Colombia.
Resumen
La importancia de los cultivos celulares humanos continúa expandiéndose, en especial en el campo de la bioingeniería de tejidos. Con el fin de establecer mejores criterios de selección en la obtención de tejido renal postmortem, se estudiaron 111 neonatos de < 3 días de edad, fallecidos en la sala de Cuidados Intensivos del Recién Nacido (CIRENA) y 22 mortinatos de la sala de partos del Hospital Universitario del Valle (HUV) en Cali, Colombia, entre enero 1 y diciembre 31 de 1995. Se consideraron los antecedentes maternos y fetales, en busca de variables que determinen una mejor viabilidad celular renal postmortem (VCRP). Además, se hizo un estudio del estado microbiológico de los neonatos postmortem y de los mortinatos mediante el examen de sangre y células para conocer la incidencia en estos de infecciones bacterianas y virales. De los 133 casos estudiados, 115 (86%) fueron de bajo peso al nacer (BPN), vgr. 500 a 2,500 gramos y los 18 (14%) restantes fueron de peso adecuado al nacer (PAN) >2,500 gramos. De 13 clases de diagnóstico registrados como antecedentes maternos, los seis más frecuentes fueron: ruptura prematura de membranas (RPM) - 20%, PRE-eclampsia/eclampsia (PE) - 13%, corioamnionitis (CA) - 11%, infección urinaria (IU) - 11%, placenta previa (PP) - 9% y vaginitis (V) - 8%. De los ocho diagnósticos registrados en los neonatos, los dos más frecuentes fueron el síndrome de dificultad respiratoria (SDR) y la enfermedad de membrana hialina (ME) -73%.
Se pudo observar que la VCRP total fue de 65%, siendo mayor en los casos con BPN (69%) que en los de PAN (39%). Independientemente de los antecedentes maternos se observó una VCRP de 70% y 77% en los casos con diagnóstico de SDR y EMH, respectivamente. Por otra parte, se obtuvo la mayor VCRP en los casos con diagnóstico materno de PP (83%). Aunque por el bajo número de casos expuestos en el presente estudio estas diferencias no demostraron significancia estadística, estos resultados son consistentes con los antes publicados.
Se obtuvieron 6 casos (4.5%) con cultivos bacteriológicos positivos (Klebsiella pneumoniae-2, Bacillus subtilis-2, Pseudomona aeuroginosa-1, Staphylococcus aureus-1) compatibles con el diagnóstico de sepsis neonatorum. Pruebas de tamizaje inicial con "rapid plasma reagin" (RPR) detectaron 10 (7.5%) muestras positivas que plantean la posible presencia de anticuerpos asociados con sífilis en esta población al momento del parto. Estos resultados ameritan investigar mas a fondo la prevalencia y estadios reales de sífilis en esta población de RPR positivos con pruebas más especificas como VDRL y FTA-ABS. No se detectó seroreactividad para el virus de inmunodeficiencia humana (VIH) ni de hepatitis B.
Este estudio, al igual que otros anteriores, sugiere una mayor VCRP en aquellos casos con diagnósticos que pudieran asociarse con una menor madurez fetal, como BPN, EMH/SDR, PP, y PE. Se podría esperar entonces que, a menor madurez fetal, mayor posibilidad de encontrar tejidos que den una mejor viabilidad celular. Estudios continúan en curso para que nos ayuden a establecer pautas para mejorar la selección de casos que nos permitan obtener cultivos celulares con mayor viabilidad.
Introducción
La tecnología de los cultivos celulares in Vitro se inició a principios del siglo con los trabajos de Harrison y Carrel 1, 2, pero su aplicación en la investigación módica sólo fue posible años más tarde.
La dificultad de obtener y mantener cultivos de células bacteriológicamente estériles fue la limitante en el desarrollo de esta tecnología. El descubrimiento de los antibióticos cerca de la mitad del siglo y su incorporación en los medios para cultivos celulares obviaron dicha dificultad, y más recientemente, el desarrollo de la criobiología hizo posible mantener en congelación en nitrógeno líquido, a muy bajas temperaturas, células vivas por períodos ilimitados de tiempo. Estos son un ejemplo de cómo un descubrimiento científico abre las perspectivas de otros. En efecto la tecnología del cultivo de células in vitro se ha convertido en un medio extraordinario en la investigación científica módica y su aplicación en los problemas de la salud humana y animal ofrece enormes posibilidades3.
La mayor aplicación de los cultivos celulares in vitro ha estado tradicionalmente relacionada con las investigaciones de los virus en el terreno básico, epidemiológico, clínico y en el desarrollo de vacunas contra enfermedades virales humanas y animales y ha reemplazado en grado altamente significativo el uso de animales de laboratorio para éstos y otros fines. En un trabajo recientemente publicado por nosotros, se presentó un resumen sobre la aplicación actual de la tecnología de cultivos celulares in vitro y las experiencias locales de la misma en estudios sobre virus 4 .
Hasta ahora la metodología clásica para cultivar células in vitro ha sido, o bien la siembra de éstas con medios nutritivos en superficies planas de botellas
de vidrio o de plástico en las cuales se adosan y multiplican hasta formar una lámina uniforme bidimensional de células -2D-, o en suspensiones de células libres en el medio nutritivo, siempre bajo la influencia normal de la gravedad.
En los últimos años se ha diversificado la aplicación de cultivos celulares in vitro extendiéndose a otras disciplinas de la investigación científica módica. Una de las proyecciones más importantes es el desarrollo de los cultivos celulares tridimensionales 3D- y de órgano idees in vitro, mediante la ingeniería de tejidos, y quizá en un futuro de los órganos bioartificiales. Estos avances científicos se han derivado de la experimentación con cultivos celulares en condiciones de microgravedad, en vuelos espaciales o simulados.
En el presente decenio se han desarrollado equipos que nos permiten avanzar en estos conocimientos. El bio-reactor HARV (High-Aspect Ratio Vessel) diseñado por la NASA y disponible comercialmente (Synthacon Inc., Houston, Texas) es un ejemplo de estos avances5. Esencialmente células vivas aisladas de tejidos son suspendidas en un medio nutritivo dentro del reactor, (el cual está provisto de un mecanismo para intercambio de gases y nutrientes) y mantenidas a pequeñas velocidades de rotación para obtener un vector neto de cero gravedad. En estas condiciones las células se orientan tridimensionalmente respecto de las demás simulando las relaciones de continuidad que tenían en el tejido de origen.
Un avance adicional de estos descubrimientos es la incorporación en el bio-reactor de soportes para las células a partir de polímeros como el ácido poliglicólico fibroso. Este soporte favorece el adosamiento tridimensional de las células y se degrada en la medida en que el elemento tisular se incrementa6, 7.
El objetivo a largo plazo de los trabajos en este campo está orientado al uso potencial de la microgravedad como un recurso para la formación in vitro de estructuras tisulares fisiológicamente importantes.
Mediante la aplicación de estos sistemas se han obtenido, a partir de células aisladas de órganos de animales, estructuras tisulares in vitro que semejan de alguna manera los tejidos de estos órganos. Corazón, cartílago, músculo esquelético son un ejemplo de estos logros8, 9. De este último se ha conseguido, mediante la incorporación de sistemas de perfusión continua en los bio-reactores, obtener organoides potencialmente utilizables para reemplazo de órganos o en terapia genética10. Independientemente de los sistemas descritos, se han hecho estudios con explantos de riñón embrionario humano y de animales in vitro para establecer el papel de algunos factores de crecimiento en el desarrollo de este órgano en el embrión11, 12.
El nuevo campo de la ingeniería de tejidos ofrece por lo tanto muchas oportunidades para la aplicación actual en la clínica y de investigación hacia la solución del problema de transplante de órganos. Los investigadores han intentado el uso de la ingeniería de tejidos para virtualmente todo tipo de éstos, entre otros, células de sistema nervioso en la enfermedad de Parkinson, regeneración de nervio periférico, células epiteliales de córnea precultivadas sobre matrices de hidrogeles de alcohol polivinílico, reemplazo de hígado con hepatocitos, y modificaciones a las técnicas actuales en el transplante de dermis y epidermis para las quemaduras. Igualmente se han cultivado células tubulares de riñón en copolímeros de vinilo o en membranas porosas de nitrato de celulosa como un paso inicial hacia la creación de un riñón bioartificial13. Este paso no ha sido explorado todavía in vivo.
El número creciente de pacientes que necesitan transplante de órganos y la disponibilidad relativamente menor de donantes ha despertado la preocupación de los científicos para desarrollar alternativas a este limitado recurso. En Estados Unidos se logran apenas cerca de 3,000 donantes de hígado anualmente al tiempo que mueren 30,000 por falla hepática sin probabilidades de transplante. El déficit de riñones para transplante en ese mismo país es de 600,000 por año 13.
En América Latina la prevalencia anual de insuficiencia renal terminal (IRT) es aproximadamente 175 por 1,000,000 de personas. En Colombia la prevalencia anual de IRT es de 5,000 casos de los cuales solamente 300 (6%) tienen oportunidad de transplante. La experiencia de Cali en transplante renal se inicia en el Hospital Universitario del Valle (HUV) en 1986 y en la clínica Fundación Valle del Lilí (FVLL) en 1995. Hasta la fecha de publicación de este trabajo, se han efectuado 380 transplantes de riñón en Cali en un período de 12 años (x=32/año). En la FVLL, cerca de 70 pacientes se registran por año como candidatos a transplante de hígado y, por carencia de donantes, solamente a unos 10 (14%) se les puede efectuar el procedimiento. En 1993, de 300 pacientes en lista de espera para transplante renal en el HUV, solo 26 (9%) obtuvieron donante para efectuar el procedimiento14a-c.
La ingeniería de tejidos mediante la cual se han desarrollado cultivos celulares -3D- y organoides, ofrece grandes posibilidades a la investigación biomédica hacia el desarrollo de órganos bio-artificiales in Vitro los cuales serían la mejor alternativa a los transplantes.
Los precursores de los cultivos celulares -3D- y organoides son los cultivos celulares primarios tradicionales -2D- unilaminares, igualmente las suspensiones de células extraídas primariamente de los tejidos. Estos deben por lo tanto ofrecer condiciones óptimas de viabilidad y esterilidad microbiana para que los supuestos órganos bio-artificiales obtenidos de ellos puedan garantizar una alta seguridad al ser introducidos en pacientes para reemplazarles un órgano insuficiente.
La mayor experiencia en nuestros laboratorios ha sido el cultivo primario -2D- de células tubulares de riñón, obtenidas de tejido neonatal postmortem. Inicialmente nuestro interés en estos cultivos fue el disponer de un medio para estudios de virus dada la alta susceptibilidad de estas células in vitro a estos agentes15, 16.
Sin embargo, la importancia de este tipo de cultivos celulares se extiende a otros campos de la investigación biomédica, que van desde la obtención de cultivos celulares -3D- y organoides para avanzar en la investigación de los factores relacionados con la Šrgano génesis in vitro, hasta la creación de un riñón bioartificial13.
En un estudio previo en nuestro laboratorio, pudimos establecer que aproximadamente el 60% de las células extraídas de tejido renal neonatal postmortem son viables. También, que el número de casos con esta viabilidad es considerablemente superior en mortinatos de menos de 2,500 g. que en los de más de 2,500 g. Una situación similar se observó en la eclampsia -incluyendo pre-eclampsia en este término-4, 17,18.
En el presente estudio llevado a cabo en el HUV y el laboratorio de IN VITRO, Departamento de Microbiología de la Universidad del Valle en Cali, Colombia se pretende:
Materiales y métodos
Datos clínicos. Se incluyeron en el estudio neonatos de < 3 días de edad que murieron en la sala de Cuidado Intensivo del Recién Nacido (CIRENA) y mortinatos de la sala de partos del Hospital Universitario del Valle (HUV) durante un período de un año comprendido entre Enero 1 y Diciembre 31 de 1995. Se recolectó la información clínica perinatal (materna y neonatal) correspondiente previa autorización informada. Cuando se presentó más de un diagnóstico en la historia clínica de la madre y/o del neonato postmortem, se tomó el primero dado para cada uno.
obtención y proceso de muestras post-mortem. Se obtuvieron muestras de sangre y de tejido renal del neonato dentro de las primeras 3 horas post mortem y de los mortinatos dentro de las primeras 3 horas post partum, mediante técnica aséptica en la morgue del HUV, previa autorización informada. No se utilizaron casos que presentaron mala apariencia macroscópica del tejido. La sangre se obtuvo mediante punción cardiaca usando jeringa de plástico estéril desechable con aguja calibre 21. La obtención del tejido renal se efectuó siguiendo la misma técnica descrita anteriormente, lo mismo que para la extracción enzimática de las células renales en el laboratorio mediante el uso de colagenasa 4 . Esta técnica no se modificó, con el fin de eliminar variables que pudieran desvirtuar la confiabilidad en la comparación de la viabilidad celular en los dos estudios llevados a cabo en períodos distintos de tiempo. Al contar las células extraídas por el método de exclusión de azul tripan se definió "caso con células viables o viabilidad celular renal postmortem (VCRP)" aquel donde la viabilidad celular o número de células viables identificadas al microscopio fue > 50%.
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