REVISTA DE INFERTILIDAD
FRAGMENTACIÓN CITOPLASMÁTICA
La formación de vesículas (ampollas) citoplasmáticas anucleares o fragmentos durante el comienzo del desarrollo embrionario in vitro se observa con frecuencia y parece estar limitado principalmente a conceptos humanos. Con excepción de los monos, otras especies no producen fragmentos citoplasmáticos en condiciones normales (Benjamín Bracket, comunicación personal).
Los fragmentos citoplasmáticos son componentes de citoplasma unidos por membranas que son expedidas desde la superficie de ovocitos o blastómetas fertilizadas del preembrión. Los fragmentos muestran diferentes características de la membrana superficial comparadas con los blastómeros, y no contiene ADN (21). Los preembriones con excesiva fragmentación (>20%) poseen tasas de implantación más bajas que aquellos sin fragmentos. El bajo potencial de implantación de estos preembriones puede ser el resultado de una reducción en el citoplasma disponible para la normal división celular que eventualmente lleva aun número total más bajo de blastómeras (22). Además, numerosos fragmentos pueden afectar la compactación y por consiguiente, el desarrollo del blastocisto.
El período de análisis de preembriones durante 72 horas (desde la inseminación hasta la transferencia) indica que la mayoría de fragmentos citoplasmáticos se desarrollan entre la etapa pronunclear, y la primera y segunda etapa de división. Cuando la fragmentación ocurre muy rápido (cerca de las 24 horas después de la inseminación), se deteriora demasiado el desarrollo subsiguiente. En la presente experiencia del autor, >70% de los preembriones con una temperatura y pequeña fragmentación demuestran excesiva fragmentación (>20% de la superficie del preembrión) en el día 3 del cultivo. Esta pronta fragmentación citoplasmática puede iniciar un daño in vitro, o una anormalidad intrínseca del ADN preembriónico.
La formación de fragmento que tiene lugar después de la primera división, tiende a ser menos excesiva y puede que no impida el desarrollo posterior del preembrión. Estos fragmentos se desarrollan justo antes de la división de la blastómera en múltiples ampollas pequeñas sobre la membrana celular. Como sigue la división, algunas ampollas se reincorporan dentro de las blastómeras hijas mientras que otras se convierten en verdaderos fragmentos unidos por membranas. Ocasionalmente, las blastómeras individuales se pueden romper completamente en múltiples fragmentos, una señal de muerte celular.
Pero, ¿Por qué ocurre la fragmentación? Hipotéticamente, varios factores intrínsecos y extrínsecos pueden ser los responsables. Las condiciones de cultivo, la competencia citoplasmática, la integridad genética, de desequilibrio cromosómico, los desórdenes de carioquinesis y citoquinesis, y otros factores pueden contribuir a la fragmentación citoplasmática. La muerte celular programada y la apoptósis resultante se observan en preembriones atrapado y fragmentado aunque las condiciones y los factores que causan estos cambios no se conocen aún.
El análisis de cromosómas de los preembriones fragmentados por medio del método de FISH (hibridización in situ por fluorescencia) indica que >50% de estos preembriones son anormales, lo que puede ser causa de su baja tasa de implantación (23). Es interesante anotar, sin embargo, que no existe alguna relación entre la fragmentación citoplasmática y la edad de la mujer a pesar de la alta incidencia de anormalidades cromosómicas en los preembriones de mujeres mayores de 40 años.
En los días 2 y 3 del cultivo in vitro (48-72 horas después de inseminación), pueden observarse diferentes patrones de fragmentación en los diferentes preembriones. Los fragmentos pueden variar en tamaño, posición, composición, y número, con algunos preembriones que no muestren ninguna fragmentación a diferencia de otros que están tan fragmentados, que, contar los blastómeros de manera individual, es algo imposible. Con mucha frecuencia se observan diferentes patrones en la cohorte de los preembriones producidos por una mujer, sugiriendo que algunos preembriones están programados en su potencial de desarrollo. Como la fragmentación tiene lugar en diferentes etapas del desarrollo inicial (pronunciar, cigótica, y de clivaje), y muestra diferentes patrones y localización, es probable que varios mecanismos subyacentes puedan llevar a la formación de fragmentos.
La leve fragmentación (igual o <10% de la superficie del embrión) se caracteriza generalmente por pequeños fragmentos, puede incluir componentes de cuerpo polar, u con frecuencia está localizada en un área. Los preembriones con una leve fragmentación tienen altas tasas de implantación. La AHA no está indicada en estos casos a menos que otros factores clínicos, como la edad e historia de la mujer, sugieren que éste puede ser útil.
La fragmentación moderada (10-20% de la superficie del preembrión) se asocia generalmente con la presencia de blastómeras de tamaño y forma irregular. Si los fragmentos están localizados sobre una sola área, se debe a la muerte de un solo blastómero. Los preembriones con fragmentación moderada puede volverse excesivamente fragmentados durante cultivo prolongado. La AHA y el retiro de fragmentos están indicados puesto que estos preembriones poseen un potencial de implantación más bajo.
La excesiva fragmentación (igual o más del 20% de la superficie del preembrión) se correlaciona con una muy baja incidencia de implantación. Algunas mujeres expresan este grado de fragmentación en todos sus preembriones. Dependiendo de la localización y del tipo de fragmentos, hay una creciente evidencia de que algunos de estos conceptos pueden ser salvados por AHA y el retiro de fragmentos. Además de la extensión general de la fragmentación, hay otras variables más precisas que contribuyen a un patrón dado de desarrollo de fragmentos. Los fragmentos pueden estar localizados o esparcidos, libres o unidos a blastómeros, y/o de tamaño pequeño o grande.
Los fragmentos localizados hacia una sola área indican origen debido a la desintegración del cuerpo polar o a la muerte de un solo blastómero; sino fragmentos pueden ser retirados fácil y satisfactoriamente durante la AHA.
Los fragmentos esparcidos pueden estar libres en el espacio perivitelino o estar unidos a blastómeras. Si son expresivos en número y están unidos, estos pueden impedir la aposición célula-a-célula, la compactación de las blastómeras, y la implantación; si sin pocos y están libres, estos pueden ser completamente retirados durante la AHA. Los fragmentos esparcidos se originan durante las divisiones meióticas (segmentación) y puede aumentar en número con cada división subsiguiente. La posición del plano de segmentación de la blastómera puede determinar las localizaciones de los fragmentos esparcidos.
Los preembriones que poseen múltiples
fragmentos que son grandes e irregulares poseen una tasa de
implantación relativamente baja. Los fragmentos grandes son, por
lo general, difíciles de distinguir de los blastómeros en
segmentación a menos que se puedan ver los núcleos, puesto que
los blastómeros buenos se vuelven más pequeños con cada
división mitótica sucesiva. Los preembriones con estas
características anormales tienen un pronostico pobre de
implantación debido a su deficiente citogénesis y a su reducida
viabilidad en cultivo. Puede intentarse el retiro agresivo de
fragmentos en estos conceptos, pero los resultados son,
generalmente pocos.
MORFOLOGÍA I BAJA TASA DE DESARROLLO DEL PREEMBRIÓN
Los preembriones de lento crecimiento,
definidos como 6 células, al día 3 de inseminados, (68-72 horas
después de inseminación) tienen una tasa de implantación en el
útero más altas después de tratamiento AHA comparados con los
no tratados con AHA de similar lento crecimiento (15). Se
especula que el orificio en la zona pelucida puede provocar un
transporte más fácil de nutrientes e igualmente, facilita la
incubación in vitro. Otras características del preembrión que
pueden ser indicaciones para el AHA son el tamaño y la forma
irregular de las blastómeras (implicadas en citoquinesis
anormal), citoplasma manchado o de apariencia insana, inclusiones
y vacuolas citoplasmáticas, y otras anormalidades visibles a
través del microscopio de luz.
HISTORIA REPRODUCTIVA PREVIA
El estudio cuidadoso de historias médicas
previas y el análisis de anteriores resultados ayuda a
determinar las mejores opciones de tratamiento para las parejas
que están llevando a cabo los tratamientos de reproducción
asistida. La mayoría de mujeres producen preembriones de calidad
muy similar a lo largo de múltiples ciclos de tratamiento. Esto
permite una predicción anticipada, si bien, no infalible de la
calidad de preembrión en los siguientes ciclos. Si la calidad
del preembrión ha sido baja en el pasado, los protocolos de
estimulación ovárica puede, igualmente, cambiarse o
modificarse, las fuentes de proteína para el medio de cultivo
pueden ser cambiadas, intentar usar las técnicas de colcultivos,
o puede considerarse la AHA, incluso en mujeres más jóvenes.
Una clara indicación para la AHA es tener más de dos intentos y
no lograrse el embarazo.
La edad de la mujer se asocia claramente con éxito de implantación y resultado de embarazo. Con la aplicación de las técnicas de reproducción asistida, es ahora evidente que las tasas de implantación disminuye drásticamente en mujeres infértiles >40 años de edad. Por esta razón, la AHA está indicada sobre la base de la edad (independiente de la morfología del embrión) para mujeres que se acercan o que pasaron a su cuarta década de vida.
Además de la conocida disminución en el
número de evocitos genéticamente saludables de mujeres mayores,
es posible que los preembriones que se desarrollan de ovocitos
viejos pierda su pacacidad de implante debido a una alterada
posibilidad de adelgazamiento de la zona pelucida y / o en
respuesta a factores alterados en el sistema endocrino. Por lo
tanto, todos los reembriones de mujeres mayores necesitan de AHA
a menos que haya una historia de múltiples intentos fallidos de
transferencia, o una pobre calidad de los conceptos.
Recíprocamente, como los preembriones de pacientes jóvenes
(<30 años) frecuentemente se implantan, no se considera
necesario el AHA a menos que haya una historia de múltiples
fracasos de implante o una muy pobre calidad de los conceptos.
Existe una tendencia a aplicar AHA de manera más deliberada en
tanto que la edad de la mujer aumenta. En el progama de Cornell,
en el cual de un veinticinco al treinta y tres por ciento de la
población de pacientes tienen más de 40 años de edad, todos o
la mayoría de sus preembriones son manipulados antes de la
transferencia intrauterina, logrando una tasa de embarazo
clínico en estas mujeres (embarazo confirmado por ultrasonido)
por tranferencia, que excede el 35%. Aunque esta proporción es
mucho más baja que la de las pacientes más jóvenes, es alta,
comparada con las estadísticas mundiales de Reproducción
Asistida que tienen que ver con tasas de embarazo en mujeres de
edades similares.
La determinación de la hormona folículo estimulante (FSH) en la fase folicular temprana, día tres del ciclo menstrual, con resultados elevados (>15mlU/ml) indica una baja reserva ovárica y por lo tanto una fisiología ovárica alterada. Estos cambios, pueden afecta al ovocito y al medio de la zona peludica dentro del folículo (18). Se ha demostrado que pacientes con elevados niveles basales de FSH se beneficia de la AHA, logrando una duplicación en las tasas de implantación comparadas con los controles no incubados (14).
En casos específicos, los pacientes sin
una clara indicación médica pueden solicitar la AHA para
aumentar sus probabilidades de quedar embarazadas. Los resultados
de nuestro programa durante los últimos 3 años sugieren que la
AHA no produce efectos secundarios en el desarrollo posterior de
preembrión (hasta donde se sabe), incluso en pacientes más
jóvenes con conceptos que muestran una buena morfología.
Las técnicas que tiene que ver con el uso
del medio At (pH 2.35) se usan con más frecuencia para la AHA.
En este procedimiento, una cantidad por minuto de la solución
acídica se usa para disolver una porción muy pequeña de la
zona pelucida. Si la exposición de la solución es breve, no
sucede ningún efecto negativo.
En el programa de Cornell, el procedimiento
se realiza sobre la placa de calor de un microscopio invertido
Nikon Diaphot equipado con dos manipuladores dirigidos por motor
y con fuertes controles y dos micromanipuladores hidráulico
(MM-188 y MO-109, Narishige Co. Ltd, Tokyo, Japón). Las
micropipetas están ajustadas a un portaherramientas controladas
por dos microinyectores IM-6 (Narishige Co. Ltd). El AHA se
realiza con un aumento de 400 veces utilizando lentes
"Hoffman Modulation Contrast".
MEDIO DE CULTIVO
Utilizamos medio HTF-Hepes suplementando
con un 6% de fracción de proteína de plasma humano
(Plasmante™) se utiliza para hace goticas en un plano pando
Petri (Falcon 1006). Una sola gota de medio AT se agrega al plato
y encerrado en un círculo rojo para distinguirla de las goticas
que contendrán preembriones. Todas las goticas (10ul) se cubren
con aceite mineral liviano equilibrado (BDH ltd, Poole, Uk).
Antes de comenzar con el procedimiento, el plato Petri se tapa
fuertemente debido al Hepes que hay en el medio y se lleva a una
incubación hasta que sea necesario. Se pueden manipular hasta 4
preembriones a la vez, con un preembrión por gota.
Las micropipetas para sostener y una
incubar son hechas de tubos capilares de vidrio esterilizado de
borosilicato (Drummond Scientific, Broomall, PA, USA.) que tiene
un diámetro externo de 0.97 mm, interno de 0.69mm, y de largo
78mm. Las pipetas son hechas dibujando los tubos capilares de
vidrio de pared delgada con un extractor de microelectrodos
horizontal (modelo 753, Campden Instruments Ltd, Loughboroungh,
UK). La micropipeta para tenencia se corta y es pulida al fuego
en un micro-horno (Narishige Co. Ltd) hasta lograr un diámetro
exterior de 60 a 80 pulida al fuego en un micro-horno (Narishige
Co. Ltd) hasta lograr un diámetro exterior de 60 a 80 de
borosilicato (Drummond Scientific, Broomall, PA, USA.). Ambas
micropipetas se ponen muy cerca una de la otra y se enfocan antes
de ser usadas.
Utilizando una ampliación de 200 veces, la micropipeta AHA se carga con una solución AT antes de cada procedimiento de incubación insertando solamente la punta de la micropipeta en el medio AT. Una vez está llena, la micropipeta se retira del plato. Luego, una gota que contenga el preembrión se mueve hacia el centro del plato, y el preembrión se visualiza. Luego, el preembrión se pasa a la micropipeta de tenencia de tal forma que la micropipeta de la AHA se alinee, bien sea con el espacio perivitelino vacio entre los blastómeros o con un área que contenga fragmentos citoplasmáticos (posición de reloj 3:00).
Utilizando una ampliación de 400 veces, la micropipeta AHA se introduce dentro de la gota hasta un punto donde la zona pelucida y la punta de la micropipeta estén ambas en el foco. Con la micropipeta AHA tocando delicadamente la zona, la solución AT se expulsa con cuidado sobre una pequeña área (20 - 30 cm). Pequeños movimientos circulares y / o de arriba hacia abajo ayudan a la rápida disolución de la cubierta de proteinasa mientras que la capa interna puede mostrar más dificultad en disolverse. Sin embargo, tan pronto como la zona sea penetrada, la expulsión de AT debe detenerse inmediatamente y seguirse por una leve succión para remover cualquier solución acídica del área. El exceso de solución AT también se retira del espacio perivitelino y de la superficie de la zona usando movimientos circulares. Finalmente, se mueve el preembrión al otro lado opuesto de la gota antes de regresarlo al lado del orificio para limpiar luego el área del medio AT por aspiración. Es esencial un retiro completo y rápido de la solución para proteger el preembrión de cambios en el pH que son, de hecho, difíciles de observar. Cuando haya dudas, se pueden agregar tintas no tóxicas a la solución AT para aumentar la visibilidad.
Las zonas de diferentes preembriones pueden responder de manera diferente a la solución acídica. En general, sin embargo, se hace una abertura muy fácilmente en unos pocos segundos aunque, ocasionalmente, se pueden encontrar algunas dificultades. En algunos casos, la zona es demasiado elástica o parece estar conectada a los blastómeros.
El tamaño del orificio en la zona no debe ser muy pequeño (<20um); las aberturas que son inadecuadas en tamaño han estado implicadas en caso de incubación dañada, blastocistos atrapados, y duplicación monocigótica. Recíprocamente, un orificio muy grande puede resultar en pérdida de blastómeras si la transferencia intrauterina es difícil.
Si no es necesario remover fragmentos, se libera el preembrión de la micropipeta de tenencia y el medio AT se recarga para repetir el procedimiento al próximo preembrión. No es necesario cambiar micropipetas entre los preembriones de un solo paciente. Al completar la AHA, todos los preembriones se lavan con por lo menos, cuatro gotas de medio frasco antes de ser devueltos a sus cajas de cultivo.
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