COCULTIVO EMBRIONARIO:
MEJORÍA DE LA IMPLANTACIÓN.

Valbuena, D. Simón, C*
Embryo Coculture: Implantation improvement.
*Instituto Valenciano de infertilidad. Calle Guardia Civil N.
23, 46020, Valencia, España

Palabra clave: Endométrio, embrión, colcultivo, implantación.

INTRODUCCIÓN

La implantación embrionaria en la especia humana es regulada por muchos y muy importantes factores, los cuales permiten el éxito de la misma en un 30% de los ciclos considerados fébriles 81). Con las técnicas de reproducción asistida este porcentaje no ha podido superarse, a pesar del estudio intenso durante los últimos 20 años.

Se ha demostrado que debe existir un adecuado ambiente hormonal (Estradiol y Progesterona) que actúa de forma endocrina sobre los órganos maternos implicados en el embarazo tradudiéndose esto en una buena receptividad uterina(2). Se conoce también que debe existir una fecundación y desarrollo embrionario normal (3). Además, estudios recientes han encontrado la gran importancia de un intercambio paracrino y/o autocrino entre los dos (4-5). Lo anterior solo puede lograrse en un momento y lugar determinado, lo cual se denomina "ventana de implantación! (6).

El concepto de desarrollo embrionario hasta blastocisto, ha surgido de la necesidad de mejorar resultados en pacientes que han sufrido fallos repetidos de gestación, a pesar de la transferencia de embriones considerados normales (7). La observación de un desarrollo embrionario temprano adecuado hasta el estado de blastocisto en medios de cultivo y en cocultivos con diferentes tejidos, ha degenerado la utilización de los mismos con diversos resultados (8 - 9). El colcultivo con células epiteliales del endométrio humano, aporta las condiciones bioquímicas y biofísicas más fisiológicas y se ha asociado a la liberación óptima de sustancias que favorecen la implantación por parte del mismo (10 - 11). Además de permitir una sincronía mayor en tiempo, y por tanto, condiciones morfológicas y fisiológicas adecuadas entre el embrión y el endométrio, permite una "autoselección" de embriones, y la posibilidad de su estudio genético en el estado preimplantatorio.

En esta revisión incluimos varios estudios practicados en nuestro Instituto, que demuestran que el tejido ideal para el cocultivo embrionario, y el más obvio, por ser el que reconoce durante toda la gestación como compañero: el epitelio del endométrio materno.

DESARROLLO EMBRIONARIO - BLASTOCISTO

Una vez se produce la fecundación, el embrión debe desarrollarse de manera óptima durante su paso por la trompa y la llegada al útero hasta que se produzca su implantación en el fondo uterino (6 días de gestación) (12). Un gran número de embriones se pierden en este trayecto, y otra importante cantidad se pierde incluso después de implantar y antes de la siguiente menstruación (abordo preclínico) (1). Esto es debido en parte a una mala calidad embrionaria, que puede ponerse de manifiesto en las primeras etapas de la división embrionaria. En los cultivos y cocultivos embrionarios se observa como la primera división embrionaria (que se produce a las 48 horas de fecundación), no es suficiente para evaluar la función y calidad embrionaria. Si se sigue el desarrollo embrionario hasta el estadio de blastocisto (6 día), solo el 50% de los embriones aparentemente normales llega al estado de blastocisto (8). La anterior observación demuestra la importancia de una evaluación continuada durante las primeras divisiones embrionarias, con lo cual es posible una "autoselección" de los embriones para la transferencia embrionaria (y posible congelación), un diagnóstico respaldado objetivamente en caso de mala calidad embrionaria y la posibilidad de practicar biopsia de blastómeras para determinación de sexo en caso historia de enfermedades genéticas ligadas al sexo, y el estudio preimplantatorio de otras enfermedades congénitas (13 - 14). Además la mayoría de las transferencias embrionarias se realizan hoy en día directamente en el útero, con lo que el embrión debe flotar tres o cuatro días en la cavidad uterina hasta que se produzca su implantación y debemos recordar que en el embarazo espontáneo el embrión llega al útero entre el 4 y 5 día de concepción, en estado de mórula y su implantación se produce en el 6 día, en estado de blastocisto, esta sincronía es otro punto importante a favor del desarrollo embrionario preimplantatorio in vitro (13 - 14). Sin embargo, en la actualidad estamos limitando el cocultivo embrionario a casos de "falso de implantación", en embriones aparentemente normales.

RECEPTIVIDAD ENDOMETRIAL

Tan importante como la calidad embrionaria es la receptividad uterina para el éxito en la obtención de una gestación. Durante el ciclo menstrual el endométrio sufre cambios y cada estadio del mismo tiene una función específica, es así como por ejemplo, en el momento de la implantación el endometrio y más exactamente la superficie de las células del epitelio endometrial presenta la aparición transitoria de unas estructuras denominadas pinópodos, considerados hoy en día como marcadores de receptividad uterina, y que solo aparecen en el momento de la implantación (15). Se requiere de una perfecta sincronía entre el desarrollo embrionario y la cronología endometrial para que se produzca la fijación del blastocisto (16). Las transferencias uterinas se practica frecuentemente en el día + 2 después de la aspiración folicular y la implantación se va a producir solo hasta el día +6m esto significa que el embrión llega demasiado pronto a la cavidad uterina y tiene que estar flotando en ella 4 días, además de la asincronía que existe entre la receptividad uterina y el desarrollo embrionario, que parece ser causada por las condiciones de los cultivos (17 - 18). Esta asincronía se ha tratado de reducir con la administración temprana de al Progesterona (17), pero esto ha causado el cierre prematuro embrionaria a blastocisto para su posible adhesión al endometrio (19).

Otra razón importante de fallos de implantación en ciclos de Reproducción Asistida son los valores suprafisiológicos de Estradiol, que afectan la receptividad uterina (20 - 21), lo mismo que parece que afectan directamente el metabolismo del blastocisto (22).

EPITELIO ENDOMETRIAL:
COCULTIVO IDEAL

Se han empleado distinto medios y tejidos para el desarrollo embrionario in vitro. Los medios de cultivo utilizados han sido variados, desde productos comerciales utilizados correctamente en los laboratorios para mantener los embriones en su primera división, como el IVF, que demuestra que no tiene aplicación para las siguientes divisiones; así como el M3, y otros productos destinados al desarrollo embrionario in vitro, con mejores resultados que el anterior pero sin exceder el 53%, hasta trompa bovina, líquido peritoneal y suero. Se sabe que los medios de cultivo tienen sustancias embriotóxicas que provocan la fragmentación de los embriones y una viabilidad disminuida, tanto en embriones animales como humanos (17-18).

La utilización de tejidos para cocultivos de origen animal y humano como células Vero (13, 23 - 25), trompa bovina (10, 26 - 27), cúmulos ooforus (28), endometrio (29 - 30), e incluso combinaciones de diversos tejidos aportan resultados variables (tabla 1). El modelo propuesto mas fisiológico ha sido el planteado por Bongso y cols (10), en el cual cocultivan secuencialmente los embriones en células de trompa hasta el estadio de 4 - 8 células y posteriormente en células endometriales mixtas (estoma y glándula). Este cocultivo ideal resulta técnicamente dificultoso por la obtención del tejido requerido.

TABLA 1
Porcentajes de blastocistos obtenidos con diferentes tipo de cocultivos

Teniendo en cuenta que el ambiente más fisiológico para el embrión lo representa el endometrio, nuestro grupo ha estudiado los cocultivos con células procedentes del mismo, básicamente del estroma y de las células epiteliales glándulares (primer sitio de interacción del embrión con el endometrio), comprobando la respuesta embrionaria en términos de secreción del sistema de la Interleukina-1, molécula de especial importancia para la implantación embrionaria (11), demostrando que se expresa mejor en el cocultivo con epitelio endometrial y alcanzando tasas de obtención de blastocistos de hasta 59% y de gestación de 28% (ver tabla 2), y hasta de 50% en pacientes receptoras de ovocitos (tabla 3). Hay que tener en cuenta que este grupo de pacientes no han quedado gestantes en al menos tres ciclos anteriores de FIV. Otra razón importante para la utilización de endometrio en cocultivo es que el mismo está dotado de una gran actividad metabólica, que apoya al desarrollo embrionario inicial, en el cual interviene activamente un gran número de sustancias, como factores de crecimiento, inductores, sustratos y citoquinas que aumentan la actividad transcripcional del embrión (31).

TÉCNICA DE COCULTIVO

El endometrio procede de biopsia de pacientes en fase lútea, preferentemente de la misma paciente en el ciclo anterior del tratamiento, si esto es así, se congela en nitrógeno, líquido con DMEM + 10% de dimetilsufóxido + 20% suero bovino fetal (SBF). Una semana antes de la utilización del tejido, éste debe ser procesado, separando los dos tipos celulares del endometrio (glándulas del estroma) por medio de una digestión con colagenasa durante 1 hora a 370°C, se sedimenta y se lava con DMEM 3 veces y posteriormente se filtra, se resuspende al 1% de SBF y se cultiva en frascos de cultivo para lograr la obtención de las células epiteliales, que se cultivan finalmente en placas de 24 pocillos. Las células confluyen formando una monocapa sobre la cual se colocan los embriones (en su día 2, es decir en la primera división embrionaria) con medio de cultivo. Los medios pueden ser cambiados todos los días o cada dos días y diariamente se valora el desarrollo embrionario, que regularmente alcanza el estadio de mórula en el día 4 y de blastocisto en el 5, en el que se hace la transferencia uterina de 2 (máximo 3 embriones).

La preparación endometrial para pacientes receptoras de ovocitos es la descrita por Remohí y cols. (32) y para las receptoras de sus propios embriones es la tradicional con Gonadotropinas descrita por Pellicer y cols (33). Para los dos grupos iniciamos el soporte lúteo con Progesterona en el día 1 es decir el día de la fecundación y 6 días antes de la transferencia ya que se ha comprobado que al sexto día de la administración de la progesterona es cuando aparecen los pinópodos (31) y la mejoría en los resultados con respectivo a la utilización menos días de la progesterona es evidente tanto en la tasa de gestación como de implantación.