|Lunes, abril 21, 2014

Caracterización de Linfocitos  

CARACTERIZACIÓN DE LINFOCITOS T GINGIVALES Y PERFIL DE CITOCINAS
EN PACIENTES CON PERIODONTITIS AGRESIVAS

Adriana Rodríguez, Ricardo Dueñas, Ana María Ocampo, Lina Suarez, Nelly Roa,. Grupo de Investigación en Enfermedad Periodontal, Centro de Investigaciones Odontológicas, Facultad de Odontología, Pontificia Universidad Javeriana

Hasta la fecha, está claramente establecido que el daño tisular observado en la enfermedad periodontal es de origen inmune, ocasionado por la reacción inflamatoria que conduce a la destrucción de los tejidos de soporte del diente.

Desde 1979 se expone la importancia de las células linfoides en la patogenia de la enfermedad periodontal. Trabajos realizados muestran que la lesión periodontal progresiva está poblada predominantemente por linfocitos B, mientras que en la estable se encuentra mayor proporción de linfocitos T.

Se han descrito dos grande poblaciones de linfocitos T, los T CD4+ o ayudadores y los T CD8+ o citotóxicos. La presentación de antígenos endógenos sintetizados dentro de la célula, unidos al CMH-I, activa los linfocitos T CD8+ generando una respuesta citotóxica que conduce a la muerte de la célula blanco, en tanto que la presentación de antígenos endógenos, activa los linfocitos T ayudadores para que sinteticen citocinas. De acuerdo al perfil de citocinas que producen las células activadas, se han determinado 3 subpoblaciones de linfocitos T CD4+ denominados LTH0, LTH1 y LTH2. Los TH0 tienen la capacidad de producir todas las citocinas específicas de células T, mientras que los linfocitos TH1 producen IL-2, INF-g y TNF-a, citocinas que tienen como principal función la activación de otros tipos celulares como linfocitos T CD8, macrófagos, células NK, etc; esto da como resultado la activación preferencial de la respuesta inmune celular. Los linfocitos TH2 en cambio, producen IL-4, 5, 6, 10 y 13 que actúan particularmente sobre linfocitos B, generando una respuesta de tipo humoral con síntesis de anticuerpos. El TGF-b ha sido recientemente incluído dentro del grupo de citocinas TH2.

Los linfocitos T citotóxicos producen citocinas aunque en menor cantidad que los ayudadores. Por esta razón, se estudiarán los perfiles T1 y T2 en los que se incluyen las citocinas que se encuentran en el tejido, producidas por los dos tipos celulares.

La gran mayoría de estudios han sido realizados en enfermedad periodontal crónica. Investigaciones previas utilizando tejidos extraídos de pacientes con enfermedad periodontal, muestran una controversia respecto del número y proporción de linfocitos TCD4+ y CD8+, y de las citocinas involucradas en el desarrollo de la patología. En conclusión, no se ha encontrado un perfil particular asociado a enfermedad y se propone que los linfocitos T que se encuentran infiltrando el tejido lesionado, son del tipo TH0.

A pesar de la ausencia de estudios concluyentes, a la IL-10 se le ha atribuido un papel importante en la evolución de la enfermedad. Se propone, que en la lesión estable, se presentan bajos niveles de IL-10 en tanto que en la progresiva, hay un aumento que conduce al daño tisular observado. Dentro de las funciones de esta citocina se encuentra la capacidad de inhibir la función de los macrófagos lo cual no corresponde con el papel de los macrófagos en la generación del daño tisular; además, algunas investigaciones no encuentran IL-10 en el tejido estudiado. Esto pone en duda el papel real de la IL-10 en la evolución de la enfermedad.

En razón de la controversia de la importancia de los linfocitos T y las citocinas en el daño observado en las periodontitis, y al escaso número de reportes en la literatura en periodontitis agresivas, el propósito de este trabajo es conocer las características de la reacción inmune linfocitaria T en tejido gingival de pacientes con periodontitis agresivas, para entender y comprender el mecanismo inmunopatogénico, con el fin de proponer medidas preventivas y/o curativas de la enfermedad.

Objetivo general: describir la localización y activación de poblaciones de linfocitos T y citocinas reguladoras de la inflamación de origen inmune que predominan en tejido gingival de pacientes con periodontitis agresivas, comparado con tejido sano, para conocer el tipo de respuesta inmune desencadenada en esta patología.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

- Localizar el sitio de infiltrado linfocitario T en el tejido afectado por enfermedad periodontal agresiva, por inmunohistoquímica.
- Determinar la proporción de las poblaciones de linfocitos T en el tejido gingival y su estado de activación por citometría de flujo.
- Identificar RNA mensajero para las citocinas T1 (IL-2, INF-g), T2 (IL-4, 5, 10 13 y TGF-b) en el tejido gingival mediante la técnica RT-PCR.

MATERIALES Y MÉTODOS:

- Muestra: 20 pacientes con diagnóstico de enfermedad periodontal agresiva, según los criterios de Page 1983 y 20 individuos sanos. Serán excluidos los pacientes con compromiso sistémico y aquellos que hayan recibido tratamiento periodontal y/o antibioticoterapia, en los 3 meses anteriores a la recolección de la muestra.

- Tejido: se tomarán biopsias de tejido gingival adyacente a la cresta alveolar de zonas con bolsas periodontales verdaderas mayores de 6 m y activas (con sangrado y exudado). De los individuos sanos se tomarán tejidos extraídos por indicación terapéutica como cirugía prepotésica. 10 muestras serán utilizadas para localización de poblaciones de células T y 10 para extracción de RNA para citocinas y activación de poblaciones de linfocitos T.

- Inmunohistoquímica: las biopsias se colocarán en formalina al 10% para la realización de bloques de parafina de los que se harán cortes de 5 ?m. Para la identificación de las poblaciones se utilizarán anticuerpos monoclonales anti-CD3, anti-CD4 y anti-CD8. La reacción será evidenciada con la adición de un anticuerpo anti-ratón conjugado con peroxidasa. Posterior al revelado con el sustrato (DAB), los cortes se analizarán con el software Carl Zeiss Vision KS300.

- Citometría de flujo: la biopsia congelada será disgregada en forma mecánica y por adición de colagenasa. Una vez las células estén en suspensión, se adicionarán anticuerpos monoclonales anti-CD3 con FITC, anti-CD4 con PE, anti-CD8 con APC. Para determinar la activación de las células, se utilizará un anticuerpo monoclonal anti-CD69 con PerCP.

- RT-PCR: el tejido será macerado en nitrógeno líquido y se extraerá el RNA con el kit SV total RNA isolation de Promega; el procedimiento se fundamenta en tres pasos principales: lisis celular, tratamiento con DNAsa, precipitación y elución del RNA. Para la síntesis del DNA copia a partir del RNA, se utilizará el kit First Strand cDNA Synthesis de Promega. En resumen, el RNA extraído se mezcla con deoxinucleotidos y transcriptasa reversa. A partir de la banda de DNA copia, se hará PCR para cada una de las citocinas en estudio. Para cada citocina se emplearán primers específicos que diferencian el DNA copia del DNA genómico. Los productos amplificados se evidenciarán mediante electroforésis en agarosa al 1.5% con bromuro de etidio. El tamaño esperado de cada una de las bandas se comparará con un patrón de DNA. Para confirmar el RT-PCR se hará retrotranscripción del RNA para b-actina. Como control positivo de las citocinas, se obtendrán células mononucleares de sangre periférica activadas con concanavalina A.

Hasta el momento se han tomado la totalidad de las muestras para inmunohistoquímica y se ha estandarizado el procedimiento. También se tiene estandarizado el RT-PCR para b-actina.

Los resultados de este trabajo permitirán establecer si realmente las células T y las citocinas tienen un papel relevante en la patogenia de la enfermedad periodontal.

Este trabajo está financiado por Colciencias y la Facultad de Odontología de la Pontificia Universidad Javeriana.

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